Vorlesung 4 Flashcards
Was ist ein Operon und welche Komponenten gehören dazu?
Operon: DNA-Abschnitt für die gemeinsame Regulation aufeinanderfolgender Gene in Prokaryoten.
Promoter: Minimale Region, die die Genaktivität steuert; Eintrittsstelle der RNA-Polymerase.
Operator: Kontrollregion für die Transkription, Bindungsstelle für den Repressor.
Strukturgene: Kodierung für spezifische Enzyme oder RNAs.
Polycistronische mRNA: mRNA, bestehend aus Sequenzen, die von mehr als einem Strukturgen abgeleitet sind.
Welche Gene sind im lac-Operon enthalten und wofür kodieren sie?
lacZ-Gen: Kodiert für das Enzym ß-Galaktosidase, das Lactose in Glucose und Galactose spaltet.
lacY-Gen: Kodiert für eine Permease, ein Enzym in der Bakterienmembran, das für den Transport von Lactose in die Zelle verantwortlich ist.
lacA-Gen: Kodiert für eine Transacetylase, deren Funktion nicht vollständig bekannt ist, aber eine Acetylgruppe auf Lactose übertragen kann.
Was passiert bei der negativen Genregulation im lac-Operon?
Ein Repressor bindet an die Kontrollregion eines Strukturgenes und verhindert die Transkription des Gens. Repressorproteine, die von Regulatorgenen kodiert werden, vermitteln die Signalwirkung kleinerer Effektormoleküle.
Repressoren können nur in Abwesenheit des Effektors (Substrat eines der kodierten Enzyme) an ihre Operatorregion binden und blockieren somit die Aktivität des betreffenden Gens oder Operons.
Welche Funktionen hat die ß-Galaktosidase im lac-Operon?
Spaltet Lactose in Glucose und Galactose, die in die Glykolyse eintreten können.
Katalysiert die Transgalaktosylierung von Lactose zu Allolactose.
Spaltet Allolactose in Monosaccharide.
Allolactose bindet an den lac-Repressor und dereprimiert das lac-Operon, wodurch ein positiver Rückkopplungsmechanismus entsteht.
Was versteht man unter positiver Genregulation im lac-Operon?
Effektormolekül cAMP bindet an das cAMP-bindende Protein, das als Aktivatorprotein der Operons (z.B. Arabinose-Operon, Galactose-Operon) fungiert.
Transkription wird durch die Anlagerung des CAP-cAMP-Komplexes an die Kontrollregion stimuliert.
Die Effektivität des Aktivators hängt von der Anwesenheit bestimmter kleiner Moleküle ab, die als Effektoren wirken. Ohne angeheftete Aktivatoren hat die RNA-Polymerase (RNAP) wenig Affinität zu den Promotoren.
Wie beeinflusst die Anwesenheit von Glucose die Aktivität des lac-Operons?
Bei Anwesenheit von Glucose sinkt die intrazelluläre Konzentration von cAMP, was die Transkription der Operons, die Enzyme zum Abbau anderer Zucker kodieren, reduziert.
Glucose inaktiviert die Adenylatcyclase und aktiviert die Phosphodiesterase, was zur Reduktion des cAMP-Spiegels führt und damit die positive Regulation durch den CAP-cAMP-Komplex vermindert.
Was sind die Merkmale des L8-UV5 lac-Promoters?
L8-UV5 lac-Promoter: Eine mutierte Version des lacI-regulierten Promoters mit zwei Basenaustauschen (G -> A, C -> T an den Positionen -66 und -55) in der CAP-Bindungsstelle, die den Promoter weniger abhängig von der cAMP-Konzentration machen (Down-Mutation).
Weitere Basenaustausche (GT -> AA an den Positionen -9 und -8): Einführen einer Konsensussequenz TATAAT an Position -10 (Up-Mutation).
Welche Rolle spielt der CAP-cAMP-Komplex im lac-Operon?
Interaktion mit der C-terminalen Domäne der α-Untereinheit (α-CTD) von RNAP: Unterstützt die Bindung von RNAP-σ.
Aktiviert die Transkription von über 150 Promotoren in E. coli, indem es nach Aktivierung durch cAMP an die CAP-Bindungsstelle bindet und die DNA-Konformation ändert.
CAP-cAMP wirkt wie ein Up-Element und unterstützt die basale Transkription.
Was sind die Eigenschaften des trp-lac-Hybridpromoters tacI und wie verhält er sich im Vergleich zu anderen Promotoren?
tacI-Promoter: Ein Hybridpromoter, der durch LacI reprimiert werden kann und besser induzierbar ist als PlacUV5.
Relative Promotoraktivität:
PlacUV5: 1
Ptrp: 2,2 ± 0,2
Ptac: 11,8 ± 1,5
IPTG-Induktion: HGH (human growth hormone) wird unter Kontrolle des tacI-Promoters durch 1,0 mM IPTG induziert.
Welche Elemente enthält das pQE-Plasmid und welche Funktionen haben sie?
Optimierter Promoter/Operator-Element: Phage T5-Promoter und zwei lac-Operatoren zur effizienten Repression des starken T5-Promoters.
Synthetische Ribosomen-Bindungsstelle RBSII: Für eine effiziente Translation.
His-Tag-Kodierungssegment: Entweder 5’ oder 3’ zur Polylinker-Klonierungsregion.
Translationsstop-Codons: In allen Leseraster für die bequeme Vorbereitung von Expressionskonstrukten.
Zwei starke Transkriptionsterminatoren: t0 (Phage Lambda) und T1 (vom rrnB-Operon von E. coli), verhindern das Durchlesen der Transkription und sorgen für die Stabilität des Expressionskonstrukts.
ColE1-Replikationsursprung: Abgeleitet von pBR322.
Beta-Lactamase-Gen bla: Vermittelt Ampicillinresistenz.
Wie funktioniert die Repression durch das lacI-Gen in E. coli?
Cis-Repression: Zusätzliche LacI-Gen auf dem gleichen Vektor.
Trans-Repression: LacI-Gen auf einem zusätzlichen Vektor oder genomisch integriert.
pREP4: Koexpression von lacI erhöht die Menge des lac-Repressors und führt zu einer besseren Repressionskontrolle in trans.
pQE80L: Ermöglicht die Koexpression von lacI und Repressionskontrolle in cis.
Welche Auswirkungen hat die cAMP-Konzentration auf die Transkription des lac-Operons in Anwesenheit von Glucose?
Catabolite Repression: In Anwesenheit von Glucose in der Umgebung sinkt die intrazelluläre cAMP-Konzentration, wodurch die Transkription von Operons, die Enzyme zum Abbau anderer Zucker kodieren, reduziert wird.
Glucose-Präsenz: Führt zur Inaktivierung der Adenylatcyclase und Aktivierung der Phosphodiesterase, was die Konzentration des positiven Regulators (CAP-cAMP-Komplex) reduziert.
Was ist der Mechanismus der positiven Genregulation durch CAP im lac-Operon?
CAP (Catabolite Activator Protein): Aktiviert die Transkription, indem es nach Aktivierung durch cAMP an die CAP-Bindungsstelle bindet und die DNA-Konformation ändert.
Bindung an die C-terminale Domäne der α-Untereinheit (α-CTD) von RNAP: Unterstützt die RNAP-σ-Bindung.
Effekt auf RNAP-Affinität: Alle CAP-abhängigen Promotoren haben schwache -35-Sequenzen, sodass RNAP-σ nur mit niedriger Affinität bindet.
Funktion: CAP-cAMP wirkt wie ein Up-Element und unterstützt die basale Transkription.
Welche Mutation im lacIQ-Promoter führt zu einer verstärkten Produktion des lacI-Proteins?
Mutation im lacIQ-Promoter: C -> T Mutation in der -35 Region.
Auswirkung: Erhöht die Produktion des lacI-Proteins um das Zehnfache im Vergleich zum Wildtyp Plac-System.
Anwendung: Bessere Repression von lacI-kontrollierten Expressionssystemen.
Was sind die Merkmale der getesteten Promotoren im pDS2-Testsystem?
Getestete Promotoren: PH207, PN25, PJ5, PD/E20 und PG25 vom Phagen T5; PA1, PA2 und PA3 vom Phagen T7 und PL vom Phagen Lambda.
Integration in den Polylinker: Promotoren wurden in die Polylinker-Stelle des pDS2 integriert und steuern die Transkription der Indikatorsequenzen dhfr (Dihydrofolat-Reduktase Maus) und cat (Chloramphenicol-Acetyltransferase).
Quantifizierung der RNA in vivo: RNA/DNA-Hybride wurden an Nitrocellulose adsorbiert und mittels Autoradiographie analysiert.
