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VL7 Gro-/Net-Seq Flashcards

1
Q

Transkription = Transkriptakkumulation?

A

Nein!

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2
Q

Transkription ≠ Transkriptakkumulation.

Beispiel dafuer?

A

Transkription in 2 Zellen gleich

Trotzdem kann es unterschiedlich große Transkriptakkumulation geben

Weil Akkumulation auch abhängig von Transkriptabbau

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3
Q

Transkription

abhaengig von?

A

Elongationsrate = Polymerase Geschwindigkeit (mit 1-50kb/min stark variabel)

Transkriptionsinitiationsraten (wichtiger)

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4
Q

Transkriptionsakkumulation:

abhangig von?

A

Abhaengig von:

  • Transkriptionsrate
  • Transkriptabbau
  • -Transkripte, die nicht aus den Kern geschleust werden, werden schneller abgebaut
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5
Q

Häufigste RNA in Zelle (Masseanteil) ?

Dann?

A

Ribosomale rRNA (80%) >

tRNAs >

mRNAs (1-2%)

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6
Q

Welches Enzym transkribiert rRNA?

A

RNA Pol I

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7
Q

heterochromatin ?

kann transkribiert werden?

A

heterochromatin - sehr kompakt verpackt

kann nicht transkribiert werden

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8
Q

euchromatin ?

kann transkribiert werden?

A

euchromatin - weniger dicht verpackt

kann transkribiert werden

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9
Q

Euchromatin - Einfluss der Nukleosomen auf Transkription?

A

RNAPII Elongationskomplex quält sich durch Euchromatin

genomische Struktur beeinflusst Transkriptionsrate

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10
Q

CTD vs Transkriptionsrate

A

CTD und verschiedene Faktoren beeinflussen Aktivität / Geschwindigkeit der Pol

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11
Q

CTD (C-terminal domain) der RNAPII: Plattform für viele Faktoren/Komplexen - mit welchen Funktionen?

A

Nukleosomen: Wegräumung / Packung nachhinein wieder an DNA; Modifizierung

Erkennung von Fehler oder DNA-Schäden, rekrutiert DNA Reparatur-Machinerie

RNA-Prozessierung und -Reifung, zB Spleißfaktoren

Stabilisierung der Kappe

Ladung von Exportfaktoren (fuer Export aus Zellkern ins Cytosol)

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12
Q

Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden?

A

Lösung I:
Run-On (klassisch) / Gro-Seq (Weiterentwicklung)

Lösung II:
Net-Seq

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13
Q

Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden:

Run-on / Gro-Seq grober Ablauf?

A

Run-On / Gro-Seq:

Zeitlich limitierte Elongation in Gegenwart markierter Nukleotide

Anschließende Anreicherung der markierten RNA

Detektion der RNA

  • Einzelgennachweise: qRT-PCR; dot-blot (Run-On)
  • NGS (Gro-Seq)
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14
Q

Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden:

Net-Seq grober Ablauf?

A

Net-Seq

Aufreinigung von an Chromatin gebundenen RNA Polymerasen

Isolierung der gebundenen RNA

NGS der RNA

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15
Q

Transkriptakkumulation: Messung durch?

A

RNA-Seq

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16
Q

Run-On:

Ablauf?

A

Isolation und Aufreinigung der Zellkerne

Zellkern inkubiert mit markierten Nts

RNAPII laufen weiter (Run-On) mit markierten Nts

Bildung Run-On-Transkripte nur bei bereits begonnene Transkripte

Extrahieren der Run-On Transkripte

Dot blot assay

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17
Q

Run-On Dot Blot Assay?

grobe Ablaud?

Limitierung?

A

Welche DNA wurde transkribiert?

Membran mit fixierte DNA-Sonden von bekannte Genen

DNA hybridisiert mit Run-On-Transkripten

→ radioaktives Signal fuer transkribierte Genen

sehr limitierend → nur ein Paar Gene → deswegen Gro-Seq entwickelt

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18
Q

Waehrend Run-On - neue Transkription-Initiation?

A

Nein!

Zellkern ohne Cytosol - Energiehaushalt sinkt auf 0 = sehr wenig Energie verfuegbar

→ Pol koennen nicht neu initialisieren (braucht viel ATP)

→ keine neue Transkripte die mit gestresste Zelle zu tun haben

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19
Q

GRO-Seq ?

A

Globalisiertes Run-On and Sequencing

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20
Q

benutzt GRO-Seq radioaktive Markierungen?

A

Nein

benutzt bromiertes UTPs

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21
Q

GRO-Seq

Ablauf?

A

Kernisolation & Zugabe von Detergenzien (wie bei Run-On)

Zugabe von bromierte UTPs + normale Nukleotide

Isolierung und Hydrolysierung der RNA

Präzipitation der markierte RNA per Brom-UTP-Antikörper die auf Beads aufgebracht sind

Waschen und Eluieren

Entfernung Kappe & End Reparatur

Library Preparation:

5’Ende MPSS, Illumina 1G Genom Analyzer

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22
Q

GRO-Seq

Was verhindert weitere Initiation?

A

–> Isolierung + Detergenzien (zB Sarkosyl) verhindert weitere Initiation

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23
Q

GRO-Seq

Library Preparation?

A

Library Preparation:

  • 5’, 3’ Adapter Ligation mittels weitere Bead Binding
  • Reverse Transkription, Barcodes usw
  • Amplifikation
  • PAGE- Aufreinigung
24
Q

GRO-Seq

Wie wird RNA isoliert und fragmentiert?

A

zB Ultraschall

25
GRO-Seq Befunde An TSS?
Viele Antisense Reads: RNAP feuert in falsche Richtung. Transkripte aber schnell wieder abgebaut
26
GRO-Seq Befunde An 3' Ende?
Nuklease schneidet an Signal-Sequenzen an RNA, dann wird PolyA angehängt → deswegen erwartet man ein Scharfes Ende von Reads hier Aber Polymerasen gehen nach diesem Signal doch weiter, Transkripte werden aber sofort wieder durch Nukleasen abgebaut → GRO-Seq Reads vorhanden
27
GRO-Seq Genklassen basierend auf RNAP Aktivität, durch GRO-Seq identifiziert
Klasse 1 - nicht pausiert, aktiv: Durchgehend Signal Klasse 2 - Pausiert, aktiv: Nur am Anfang starkes Signal, dann nur noch schwaches SIgnal Klasse 3 - pausiert, nicht aktiv, RNAP fängt ab und zu an, aber kommt nicht weiter (pausiert) kein Protein wird gebildet Klasse 4 - nicht pausiert, nicht aktiv Keine pausierte RNAP, gar keine gebundene RNAP kein Protein wird gebildet
28
Beispiel fuer Klasse 1 : Gen nicht pausiert, aktiv
Bsp: Gen für ribosomales Protein
29
Beispiel fuer Klass 2: Gen pausiert, aktiv
Bsp: Gen für Hitzeschockprotein
30
PRO-Seq?
= Precision nuclear run-on and sequencing weiterentwicklung von GRO-Seq
31
PRO-Seq Ablauf?
(Erste Schritte wie andere Run-Ons) Hinzugabe biotinmarkierter NTPs → nur 1 NTP eingebaut, RNA Pol stoppt RNA Isolierung: Pulldown mittels Streptavidin ( extrem hohe Affinität für Biotin) Library Preparation: Sequenzierung der 3’ Ende Adaptersequenz bekannt → man sieht genau wo RNAP gesessen hat
32
PRO-Seq Vorteil
Aufloesung steigt dramatisch
33
PRO-Seq Befunde Exons - Pausieren?
Differentielles Pausieren der RNAP an verschiedenen Exons Verstärkte Signale in Exons in Vergleich zu Introns - langsamer in Exons Gilt fuer gut gespleisste Exons - RNAP nicht so stark verlangsamt in weniger benutzte Exons
34
PRO-Seq Befunde Pausierungsstellen?
Identifizierung Pausierungstellen der RNAPol an der DNA in der Nähe des Promotors Wegen Splicing Möglicherweise Regulation durch Pausieren
35
PRO-Seq Befunde Feinkartierung des Promoter-proximalen Pausierens
Was bestimmt Pausierung? Experiment in Hsp70 promotor Pausierungssequenzelemente stomab von TSS: Abstand ist wichtig Pausierungslevel wird durch Einfügung einer Insert Sequenz, in Abhängigkeit der Länge dieser veraendert
36
Nachteile von GRO- und PRO-Seq
Limitierung: nur in Zellkulturen/artificial Systems (markierte NTPs müssen inkubiert werden) Artifacts may be introduced during preparation of nuclei (Stress --> andere Transkripte). Artifact: result ≠ biological material / function, arises from technical, often artificial, process. Unerwünschte neue Initiationen während Run-On moeglich
37
NET-Seq ?
= Native Elongating Transcript Sequencing
38
NET-Seq Unterschiede zu GRO- PRO-Seq?
Keine Kernisolierung noetig Keine Markierung noetig Bestimmt wo genau RNAP transkribiert, ohne Limitierung von PRO-Seq
39
NET-Seq Ablauf?
Einfrieren → RNAP läuft nicht weiter Zelllyse - danach soll keine RNAP Aktivität stattfinden Nachweis Experiment durch: RNAP Inhibitor alpha-Amanitin→ keine Artefakten Präzipitation der RNAP-RNA-DNA Komplex DNA Verdauung RNA Aufreinigung Library Generierung Sequenzierung
40
NET-Seq Befunde Introns, PolyA ..?
Detektion von Introns und Regionen stromabwärts von PolyA-Stellen Vergleich naszierende vs. gereifte mRNA
41
NET-Seq Befunde Cryptic Unstable Transcripts
Detektion von “CUTs” Cryptic Unstable Transcripts (akkumulieren nicht) Mögliche Grund: Transkription hat einen Einfluss auf Chromatin
42
NET-Seq Befunde Pausierungsstellen Rueckwartsgang
Pausierungsstellen (wie bei PRO-Seq) Identifikation Pausierungsstellen: ca alle 20 BP pausiert RNAP Rückwärtsgang: Nach Pausierung gehen RNAP manchmal zurück, versuchen nochmal 3’ Ende muss von Hilfsfaktor abgeschnitten werden, damit RNAP wieder freies katalytisches Zentrum hat und weitermachen kann Mutation der Hilfsfaktor ändert die Pausierungsstellen → nach rechts verschoben
43
NET-Seq Befunde RNAP Modifikationion
Analyse von spezifischen RNAPII Modifikationen mittels NET-Seq CTD Schwanz: hoch-konservierte repetitive AS-Sequenz: Y1-S2-P3-T4-S5-P6-S7 2 Serine (2 und 5) können phosphoryliert werden Modifikationsmuster kann sich verändern waehrend Transkription, von Initiation zu Elongation CTD Modifikationen verändern Eigenschaften der RNAP und ihre Interaktion mit verschiedenen Faktoren S5P modifizierte RNAPII assoziiert mit dem 3’-Ende von Exons Bsp TARS Gen mit E9 und E10: S5P hat Schlüsselrolle: starkes NET-Seq Signal am 3’-Ende des Exons Transkribiert über exon und intron, wird langsamer in exon, ein bruch entsteht am Ende der vorherige Exon, Exon wird mitgeschleppt von der Pol, obwohl sie schon im 3’ exon ist, Es gib eine ganze Reihe von Introns die gespleißt werden während noch transkribiert wird = kotranstriptionelles Spleissen
44
NET-Seq Befunde RNAP Modifikationion Modell von kotranscriptionelles Spleissen
Modell von Ko-Transkriptionellem Spleißen Neg. Ladung der S5P Phosphatgruppe ermöglicht direkte Rekrutierung von Spleißosom S5P bremst RNAP, erlaubt Ausführung des 2. Spleißschrittes während 3‘ Exon transkribiert wird 🡪 Pausierungsstellen (nojima et al)
45
1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen Begriffe erklaeren
Transkription = Transkriptionsaktivität, Transkriptionsrate, Transkription/Zeit Transkriptionsakkumulation = steady-state Zustand von Transkriptionsmenge
46
1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen Abhaengig von?
Abhaengig von: Transkription: Polymerase Geschwindigkeit, Transkriptionsinitiationsraten Transkriptakkumulation: Transkriptionsrate, Transkriptabbau
47
1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen Messung durch?
Messung durch: Transkription: Run-On, GRO- und PRO-Seq, NET-Seq Transkriptakkumulation: RNA-Seq misst Transkripte die sich in Zelle befinden
48
1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen Beispiel
Transkription in 2 Zellen gleich, | Trotzdem kann es unterschiedlich große Transkriptakkumulation geben
49
2. Nennen Sie drei Beispiele für Vorgänge, die ko-transkriptional passieren?
splicing polyadenylierung capping Ladung von Exportfaktoren (aus Zellkern ins Cytosol) Erkennung von Fehler oder DNA-Schäden, rekrutiert DNA Reparatur-Machinerie
50
3. Warum werden für einen run-on erst Kerne aus Zellen isoliert?
Damit markierte Nukleotide durch die relatven grossen Kernporen in den Kern leicht diffundieren koennen Metabolite können fast ungehindert durch Kernpore, durch Membranporen nicht so einfach
51
4. Was ist der wesentliche Unterschied zwischen Gro-Seq und Net-Seq?
GRO-Seq: - Kernisolierung - Run-On mit markierten NTPS - limitierte Elongation mit markierten Nukleotiden an isolierten Kernen, - Präzipitation der RNA anhand der bromierte NTPs NET-Seq: - keine Kernisolierung nötig - Kein Run-On, keine markierte NTPs - Nachweis Experiment (alpha-Amanitin) - Präzipitation der Polymerase mit gebundene RNA (und dNA)
52
6. Inwiefern stellt Pro-Seq eine technische Verbesserung gegenüber Gro-Seq dar?
Einzige biotinierter Nukleotid eingebaut - sperrige biotinierte NTP haltet RNAP RNA Isolierung: Pulldown mittels Streptavidin ( extrem hohe Affinität für Biotin) → Hoehere Aufloesung: bestimmt Nukleotid an dem Polymerase stoppt
53
5. Warum stirbt man nach einer Vergiftung mit Knollenblätterpilzen erst nach 1-3 Tagen, mit den ersten Symptomen meist erst nach 24 Stunden?
Inhibitor alpha-Amanitin inhibiert RNAPII → keine Bildung neuer mRNA mRNA ist noch in Zelle vorhanden aber wird abgebaut → Leberschaden 2-Phase Verlauf - Erste Symptome, dann leckphase, dann Tod - Erst Magen-Darm-Trakt Beschädigung (1. Phase), dort RNA mit sehr kurzer Halbwertszeit (~1h) -🡪 Bauchschmerzen erbrechen - Gift wandert durch Blut in Leber 🡪 dort Schädigung, Tod
54
7. Nennen Sie einen technischen Nachteil von Gro-Seq gegenüber Net-Seq.
Limitierung: nur in Zellkulturen/artificial Systems (markierte NTPs müssen inkubiert werden) Isolation der Kerne Aufwendig Wegen Stress, andere Transkripte: Artefakten koennen wahrend Kern-Präparation eingebracht werden Unerwünschte neue Initiationen während Run-On moeglich
55
8. Sie wollen die Transkription in Mitochondrien von HeLa Zellen mittels Gro-Seq messen. Welches Problem müssen Sie lösen?
Mitochondrien haben Doppelmembran mit spezifische Transportproteine → sehr selektive Permeabilität → es ist schwieriger Nukleotide einzubringen
56
8. Welche Rolle kann die Phosphorylierung der RNA Polymerase II an ihrer C-terminalen Domäne spielen?
CTD Schwanz: hoch-konservierte repetitive AS-Sequenz: Y1-S2-P3-T4-S5-P6-S7 2 Serine (2 und 5) können phosphoryliert werden Modifikationsmuster kann sich verändern waehrend Transkription, von Initiation zu Elongation CTD Modifikationen verändern RNAP Eigenschaften, ihre Interaktion mit versch. Faktoren → kotranstriptionelles Spleissen: - Neg. Ladung der S5P Phosphatgruppe ermöglicht direkte Rekrutierung von Spleißosom - S5P bremst RNAP, erlaubt Ausführung des 2. Spleißschrittes während 3‘ Exon transkribiert wird 🡪 Pausierungsstellen (nojima et al)
57
10. . Nach einer strangspezifischen Gro-Seq Analyse einer menschlichen Zelllinie erhalten Sie nicht nur erwartete Signale stromab von Promotoren, sondern bei den meisten Promotoren auch reads auf dem Gegenstrang stromauf, bis etwa zur Position -100. Wie interpretieren Sie dieses Ergebnis?
RNA Polyermase werden in falsche Richtung gefeuert → antisense Transcripte Antisense Transcripte werden schnell abgebaut ( ?? TFIIH: RNAP2 pausiert in Nähe des Promotors, braucht dort weiterer Faktoren zur Änderung Phosphrylierungstatus, erst dann ist sie prozessiert ??)

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