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BXY11 Molekularbiologie > VL7 Gro-/Net-Seq > Flashcards

VL7 Gro-/Net-Seq Flashcards

1
Q

Transkription = Transkriptakkumulation?

A

Nein!

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2
Q

Transkription ≠ Transkriptakkumulation.

Beispiel dafuer?

A

Transkription in 2 Zellen gleich

Trotzdem kann es unterschiedlich große Transkriptakkumulation geben

Weil Akkumulation auch abhängig von Transkriptabbau

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3
Q

Transkription

abhaengig von?

A

Elongationsrate = Polymerase Geschwindigkeit (mit 1-50kb/min stark variabel)

Transkriptionsinitiationsraten (wichtiger)

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4
Q

Transkriptionsakkumulation:

abhangig von?

A

Abhaengig von:

  • Transkriptionsrate
  • Transkriptabbau
  • -Transkripte, die nicht aus den Kern geschleust werden, werden schneller abgebaut
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5
Q

Häufigste RNA in Zelle (Masseanteil) ?

Dann?

A

Ribosomale rRNA (80%) >

tRNAs >

mRNAs (1-2%)

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6
Q

Welches Enzym transkribiert rRNA?

A

RNA Pol I

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7
Q

heterochromatin ?

kann transkribiert werden?

A

heterochromatin - sehr kompakt verpackt

kann nicht transkribiert werden

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8
Q

euchromatin ?

kann transkribiert werden?

A

euchromatin - weniger dicht verpackt

kann transkribiert werden

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9
Q

Euchromatin - Einfluss der Nukleosomen auf Transkription?

A

RNAPII Elongationskomplex quält sich durch Euchromatin

genomische Struktur beeinflusst Transkriptionsrate

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10
Q

CTD vs Transkriptionsrate

A

CTD und verschiedene Faktoren beeinflussen Aktivität / Geschwindigkeit der Pol

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11
Q

CTD (C-terminal domain) der RNAPII: Plattform für viele Faktoren/Komplexen - mit welchen Funktionen?

A

Nukleosomen: Wegräumung / Packung nachhinein wieder an DNA; Modifizierung

Erkennung von Fehler oder DNA-Schäden, rekrutiert DNA Reparatur-Machinerie

RNA-Prozessierung und -Reifung, zB Spleißfaktoren

Stabilisierung der Kappe

Ladung von Exportfaktoren (fuer Export aus Zellkern ins Cytosol)

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12
Q

Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden?

A

Lösung I:
Run-On (klassisch) / Gro-Seq (Weiterentwicklung)

Lösung II:
Net-Seq

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13
Q

Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden:

Run-on / Gro-Seq grober Ablauf?

A

Run-On / Gro-Seq:

Zeitlich limitierte Elongation in Gegenwart markierter Nukleotide

Anschließende Anreicherung der markierten RNA

Detektion der RNA

  • Einzelgennachweise: qRT-PCR; dot-blot (Run-On)
  • NGS (Gro-Seq)
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14
Q

Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden:

Net-Seq grober Ablauf?

A

Net-Seq

Aufreinigung von an Chromatin gebundenen RNA Polymerasen

Isolierung der gebundenen RNA

NGS der RNA

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15
Q

Transkriptakkumulation: Messung durch?

A

RNA-Seq

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16
Q

Run-On:

Ablauf?

A

Isolation und Aufreinigung der Zellkerne

Zellkern inkubiert mit markierten Nts

RNAPII laufen weiter (Run-On) mit markierten Nts

Bildung Run-On-Transkripte nur bei bereits begonnene Transkripte

Extrahieren der Run-On Transkripte

Dot blot assay

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17
Q

Run-On Dot Blot Assay?

grobe Ablaud?

Limitierung?

A

Welche DNA wurde transkribiert?

Membran mit fixierte DNA-Sonden von bekannte Genen

DNA hybridisiert mit Run-On-Transkripten

→ radioaktives Signal fuer transkribierte Genen

sehr limitierend → nur ein Paar Gene → deswegen Gro-Seq entwickelt

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18
Q

Waehrend Run-On - neue Transkription-Initiation?

A

Nein!

Zellkern ohne Cytosol - Energiehaushalt sinkt auf 0 = sehr wenig Energie verfuegbar

→ Pol koennen nicht neu initialisieren (braucht viel ATP)

→ keine neue Transkripte die mit gestresste Zelle zu tun haben

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19
Q

GRO-Seq ?

A

Globalisiertes Run-On and Sequencing

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20
Q

benutzt GRO-Seq radioaktive Markierungen?

A

Nein

benutzt bromiertes UTPs

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21
Q

GRO-Seq

Ablauf?

A

Kernisolation & Zugabe von Detergenzien (wie bei Run-On)

Zugabe von bromierte UTPs + normale Nukleotide

Isolierung und Hydrolysierung der RNA

Präzipitation der markierte RNA per Brom-UTP-Antikörper die auf Beads aufgebracht sind

Waschen und Eluieren

Entfernung Kappe & End Reparatur

Library Preparation:

5’Ende MPSS, Illumina 1G Genom Analyzer

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22
Q

GRO-Seq

Was verhindert weitere Initiation?

A

–> Isolierung + Detergenzien (zB Sarkosyl) verhindert weitere Initiation

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23
Q

GRO-Seq

Library Preparation?

A

Library Preparation:

  • 5’, 3’ Adapter Ligation mittels weitere Bead Binding
  • Reverse Transkription, Barcodes usw
  • Amplifikation
  • PAGE- Aufreinigung
24
Q

GRO-Seq

Wie wird RNA isoliert und fragmentiert?

A

zB Ultraschall

25
Q

GRO-Seq Befunde

An TSS?

A

Viele Antisense Reads: RNAP feuert in falsche Richtung. Transkripte aber schnell wieder abgebaut

26
Q

GRO-Seq Befunde

An 3’ Ende?

A

Nuklease schneidet an Signal-Sequenzen an RNA, dann wird PolyA angehängt
→ deswegen erwartet man ein Scharfes Ende von Reads hier

Aber Polymerasen gehen nach diesem Signal doch weiter, Transkripte werden aber sofort wieder durch Nukleasen abgebaut
→ GRO-Seq Reads vorhanden

27
Q

GRO-Seq

Genklassen basierend auf RNAP Aktivität, durch GRO-Seq identifiziert

A

Klasse 1 - nicht pausiert, aktiv:
Durchgehend Signal

Klasse 2 - Pausiert, aktiv:
Nur am Anfang starkes Signal, dann nur noch schwaches SIgnal

Klasse 3 - pausiert, nicht aktiv,
RNAP fängt ab und zu an, aber kommt nicht weiter (pausiert)
kein Protein wird gebildet

Klasse 4 - nicht pausiert, nicht aktiv
Keine pausierte RNAP, gar keine gebundene RNAP
kein Protein wird gebildet

28
Q

Beispiel fuer Klasse 1 : Gen nicht pausiert, aktiv

A

Bsp: Gen für ribosomales Protein

29
Q

Beispiel fuer Klass 2: Gen pausiert, aktiv

A

Bsp: Gen für Hitzeschockprotein

30
Q

PRO-Seq?

A

= Precision nuclear run-on and sequencing

weiterentwicklung von GRO-Seq

31
Q

PRO-Seq

Ablauf?

A

(Erste Schritte wie andere Run-Ons)

Hinzugabe biotinmarkierter NTPs → nur 1 NTP eingebaut, RNA Pol stoppt

RNA Isolierung: Pulldown mittels Streptavidin ( extrem hohe Affinität für Biotin)

Library Preparation:

Sequenzierung der 3’ Ende

Adaptersequenz bekannt → man sieht genau wo RNAP gesessen hat

32
Q

PRO-Seq Vorteil

A

Aufloesung steigt dramatisch

33
Q

PRO-Seq Befunde

Exons - Pausieren?

A

Differentielles Pausieren der RNAP an verschiedenen Exons

Verstärkte Signale in Exons in Vergleich zu Introns - langsamer in Exons

Gilt fuer gut gespleisste Exons - RNAP nicht so stark verlangsamt in weniger benutzte Exons

34
Q

PRO-Seq Befunde

Pausierungsstellen?

A

Identifizierung Pausierungstellen der RNAPol an der DNA in der Nähe des Promotors

Wegen Splicing

Möglicherweise Regulation durch Pausieren

35
Q

PRO-Seq Befunde

Feinkartierung des Promoter-proximalen Pausierens

A

Was bestimmt Pausierung?

Experiment in Hsp70 promotor

Pausierungssequenzelemente stomab von TSS: Abstand ist wichtig

Pausierungslevel wird durch Einfügung einer Insert Sequenz, in Abhängigkeit der Länge dieser veraendert

36
Q

Nachteile von GRO- und PRO-Seq

A

Limitierung: nur in Zellkulturen/artificial Systems (markierte NTPs müssen inkubiert werden)

Artifacts may be introduced during preparation of nuclei (Stress –> andere Transkripte).
Artifact: result ≠ biological material / function, arises from technical, often artificial, process.

Unerwünschte neue Initiationen während Run-On moeglich

37
Q

NET-Seq ?

A

= Native Elongating Transcript Sequencing

38
Q

NET-Seq

Unterschiede zu GRO- PRO-Seq?

A

Keine Kernisolierung noetig

Keine Markierung noetig

Bestimmt wo genau RNAP transkribiert, ohne Limitierung von PRO-Seq

39
Q

NET-Seq

Ablauf?

A

Einfrieren → RNAP läuft nicht weiter

Zelllyse - danach soll keine RNAP Aktivität stattfinden

Nachweis Experiment durch: RNAP Inhibitor alpha-Amanitin→ keine Artefakten

Präzipitation der RNAP-RNA-DNA Komplex

DNA Verdauung

RNA Aufreinigung

Library Generierung

Sequenzierung

40
Q

NET-Seq Befunde

Introns, PolyA ..?

A

Detektion von Introns und Regionen stromabwärts von PolyA-Stellen

Vergleich naszierende vs. gereifte mRNA

41
Q

NET-Seq Befunde

Cryptic Unstable Transcripts

A

Detektion von “CUTs”
Cryptic Unstable Transcripts (akkumulieren nicht)
Mögliche Grund: Transkription hat einen Einfluss auf Chromatin

42
Q

NET-Seq Befunde

Pausierungsstellen

Rueckwartsgang

A

Pausierungsstellen (wie bei PRO-Seq)
Identifikation Pausierungsstellen: ca alle 20 BP pausiert RNAP

Rückwärtsgang: Nach Pausierung gehen RNAP manchmal zurück, versuchen nochmal

3’ Ende muss von Hilfsfaktor abgeschnitten werden, damit RNAP wieder freies katalytisches Zentrum hat und weitermachen kann

Mutation der Hilfsfaktor ändert die Pausierungsstellen → nach rechts verschoben

43
Q

NET-Seq Befunde

RNAP Modifikationion

A

Analyse von spezifischen RNAPII Modifikationen mittels NET-Seq
CTD Schwanz: hoch-konservierte repetitive AS-Sequenz: Y1-S2-P3-T4-S5-P6-S7

2 Serine (2 und 5) können phosphoryliert werden

Modifikationsmuster kann sich verändern waehrend Transkription, von Initiation zu Elongation

CTD Modifikationen verändern Eigenschaften der RNAP und ihre Interaktion mit verschiedenen Faktoren

S5P modifizierte RNAPII assoziiert mit dem 3’-Ende von Exons

Bsp TARS Gen mit E9 und E10:

S5P hat Schlüsselrolle: starkes NET-Seq Signal am 3’-Ende des Exons

Transkribiert über exon und intron, wird langsamer in exon, ein bruch entsteht am Ende der vorherige Exon, Exon wird mitgeschleppt von der Pol, obwohl sie schon im 3’ exon ist,

Es gib eine ganze Reihe von Introns die gespleißt werden während noch transkribiert wird
= kotranstriptionelles Spleissen

44
Q

NET-Seq Befunde

RNAP Modifikationion

Modell von kotranscriptionelles Spleissen

A

Modell von Ko-Transkriptionellem Spleißen

Neg. Ladung der S5P Phosphatgruppe ermöglicht direkte Rekrutierung von Spleißosom

S5P bremst RNAP, erlaubt Ausführung des 2. Spleißschrittes während 3‘ Exon transkribiert wird

🡪 Pausierungsstellen
(nojima et al)

45
Q
  1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen

Begriffe erklaeren

A

Transkription = Transkriptionsaktivität, Transkriptionsrate, Transkription/Zeit

Transkriptionsakkumulation = steady-state Zustand von Transkriptionsmenge

46
Q
  1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen

Abhaengig von?

A

Abhaengig von:

Transkription: Polymerase Geschwindigkeit, Transkriptionsinitiationsraten

Transkriptakkumulation: Transkriptionsrate, Transkriptabbau

47
Q
  1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen

Messung durch?

A

Messung durch:

Transkription: Run-On, GRO- und PRO-Seq, NET-Seq

Transkriptakkumulation: RNA-Seq misst Transkripte die sich in Zelle befinden

48
Q
  1. Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen

Beispiel

A

Transkription in 2 Zellen gleich,

Trotzdem kann es unterschiedlich große Transkriptakkumulation geben

49
Q
  1. Nennen Sie drei Beispiele für Vorgänge, die ko-transkriptional passieren?
A

splicing

polyadenylierung

capping

Ladung von Exportfaktoren (aus Zellkern ins Cytosol)

Erkennung von Fehler oder DNA-Schäden, rekrutiert DNA Reparatur-Machinerie

50
Q
  1. Warum werden für einen run-on erst Kerne aus Zellen isoliert?
A

Damit markierte Nukleotide durch die relatven grossen Kernporen in den Kern leicht diffundieren koennen
Metabolite können fast ungehindert durch Kernpore, durch Membranporen nicht so einfach

51
Q
  1. Was ist der wesentliche Unterschied zwischen Gro-Seq und Net-Seq?
A

GRO-Seq:

  • Kernisolierung
  • Run-On mit markierten NTPS
  • limitierte Elongation mit markierten Nukleotiden an isolierten Kernen,
  • Präzipitation der RNA anhand der bromierte NTPs

NET-Seq:

  • keine Kernisolierung nötig
  • Kein Run-On, keine markierte NTPs
  • Nachweis Experiment (alpha-Amanitin)
  • Präzipitation der Polymerase mit gebundene RNA (und dNA)
52
Q
  1. Inwiefern stellt Pro-Seq eine technische Verbesserung gegenüber Gro-Seq dar?
A

Einzige biotinierter Nukleotid eingebaut - sperrige biotinierte NTP haltet RNAP

RNA Isolierung: Pulldown mittels Streptavidin ( extrem hohe Affinität für Biotin)

→ Hoehere Aufloesung: bestimmt Nukleotid an dem Polymerase stoppt

53
Q
  1. Warum stirbt man nach einer Vergiftung mit Knollenblätterpilzen erst nach 1-3 Tagen, mit den ersten Symptomen meist erst nach 24 Stunden?
A

Inhibitor alpha-Amanitin inhibiert RNAPII → keine Bildung neuer mRNA

mRNA ist noch in Zelle vorhanden aber wird abgebaut

→ Leberschaden

2-Phase Verlauf

  • Erste Symptome, dann leckphase, dann Tod
  • Erst Magen-Darm-Trakt Beschädigung (1. Phase), dort RNA mit sehr kurzer Halbwertszeit (~1h) -🡪 Bauchschmerzen erbrechen
  • Gift wandert durch Blut in Leber 🡪 dort Schädigung, Tod
54
Q
  1. Nennen Sie einen technischen Nachteil von Gro-Seq gegenüber Net-Seq.
A

Limitierung: nur in Zellkulturen/artificial Systems (markierte NTPs müssen inkubiert werden)
Isolation der Kerne Aufwendig
Wegen Stress, andere Transkripte: Artefakten koennen wahrend Kern-Präparation eingebracht werden
Unerwünschte neue Initiationen während Run-On moeglich

55
Q
  1. Sie wollen die Transkription in Mitochondrien von HeLa Zellen mittels Gro-Seq messen. Welches Problem müssen Sie lösen?
A

Mitochondrien haben Doppelmembran mit spezifische Transportproteine

→ sehr selektive Permeabilität

→ es ist schwieriger Nukleotide einzubringen

56
Q
  1. Welche Rolle kann die Phosphorylierung der RNA Polymerase II an ihrer C-terminalen Domäne spielen?
A

CTD Schwanz: hoch-konservierte repetitive AS-Sequenz: Y1-S2-P3-T4-S5-P6-S7

2 Serine (2 und 5) können phosphoryliert werden

Modifikationsmuster kann sich verändern waehrend Transkription, von Initiation zu Elongation

CTD Modifikationen verändern RNAP Eigenschaften, ihre Interaktion mit versch. Faktoren

→ kotranstriptionelles Spleissen:
- Neg. Ladung der S5P Phosphatgruppe ermöglicht direkte Rekrutierung von Spleißosom
- S5P bremst RNAP, erlaubt Ausführung des 2. Spleißschrittes während 3‘ Exon transkribiert wird
🡪 Pausierungsstellen
(nojima et al)

57
Q
  1. . Nach einer strangspezifischen Gro-Seq Analyse einer menschlichen Zelllinie erhalten Sie nicht nur erwartete Signale stromab von Promotoren, sondern bei den meisten Promotoren auch reads auf dem Gegenstrang stromauf, bis etwa zur Position -100. Wie interpretieren Sie dieses Ergebnis?
A

RNA Polyermase werden in falsche Richtung gefeuert → antisense Transcripte

Antisense Transcripte werden schnell abgebaut

( ?? TFIIH: RNAP2 pausiert in Nähe des Promotors, braucht dort weiterer Faktoren zur Änderung Phosphrylierungstatus, erst dann ist sie prozessiert ??)

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