VL7 Gro-/Net-Seq Flashcards
Transkription = Transkriptakkumulation?
Nein!
Transkription ≠ Transkriptakkumulation.
Beispiel dafuer?
Transkription in 2 Zellen gleich
Trotzdem kann es unterschiedlich große Transkriptakkumulation geben
Weil Akkumulation auch abhängig von Transkriptabbau
Transkription
abhaengig von?
Elongationsrate = Polymerase Geschwindigkeit (mit 1-50kb/min stark variabel)
Transkriptionsinitiationsraten (wichtiger)
Transkriptionsakkumulation:
abhangig von?
Abhaengig von:
- Transkriptionsrate
- Transkriptabbau
- -Transkripte, die nicht aus den Kern geschleust werden, werden schneller abgebaut
Häufigste RNA in Zelle (Masseanteil) ?
Dann?
Ribosomale rRNA (80%) >
tRNAs >
mRNAs (1-2%)
Welches Enzym transkribiert rRNA?
RNA Pol I
heterochromatin ?
kann transkribiert werden?
heterochromatin - sehr kompakt verpackt
kann nicht transkribiert werden
euchromatin ?
kann transkribiert werden?
euchromatin - weniger dicht verpackt
kann transkribiert werden
Euchromatin - Einfluss der Nukleosomen auf Transkription?
RNAPII Elongationskomplex quält sich durch Euchromatin
genomische Struktur beeinflusst Transkriptionsrate
CTD vs Transkriptionsrate
CTD und verschiedene Faktoren beeinflussen Aktivität / Geschwindigkeit der Pol
CTD (C-terminal domain) der RNAPII: Plattform für viele Faktoren/Komplexen - mit welchen Funktionen?
Nukleosomen: Wegräumung / Packung nachhinein wieder an DNA; Modifizierung
Erkennung von Fehler oder DNA-Schäden, rekrutiert DNA Reparatur-Machinerie
RNA-Prozessierung und -Reifung, zB Spleißfaktoren
Stabilisierung der Kappe
Ladung von Exportfaktoren (fuer Export aus Zellkern ins Cytosol)
Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden?
Lösung I:
Run-On (klassisch) / Gro-Seq (Weiterentwicklung)
Lösung II:
Net-Seq
Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden:
Run-on / Gro-Seq grober Ablauf?
Run-On / Gro-Seq:
Zeitlich limitierte Elongation in Gegenwart markierter Nukleotide
Anschließende Anreicherung der markierten RNA
Detektion der RNA
- Einzelgennachweise: qRT-PCR; dot-blot (Run-On)
- NGS (Gro-Seq)
Wie kann die Transkriptionsrate gemessen werden:
Net-Seq grober Ablauf?
Net-Seq
Aufreinigung von an Chromatin gebundenen RNA Polymerasen
Isolierung der gebundenen RNA
NGS der RNA
Transkriptakkumulation: Messung durch?
RNA-Seq
Run-On:
Ablauf?
Isolation und Aufreinigung der Zellkerne
Zellkern inkubiert mit markierten Nts
RNAPII laufen weiter (Run-On) mit markierten Nts
Bildung Run-On-Transkripte nur bei bereits begonnene Transkripte
Extrahieren der Run-On Transkripte
Dot blot assay
Run-On Dot Blot Assay?
grobe Ablaud?
Limitierung?
Welche DNA wurde transkribiert?
Membran mit fixierte DNA-Sonden von bekannte Genen
DNA hybridisiert mit Run-On-Transkripten
→ radioaktives Signal fuer transkribierte Genen
sehr limitierend → nur ein Paar Gene → deswegen Gro-Seq entwickelt
Waehrend Run-On - neue Transkription-Initiation?
Nein!
Zellkern ohne Cytosol - Energiehaushalt sinkt auf 0 = sehr wenig Energie verfuegbar
→ Pol koennen nicht neu initialisieren (braucht viel ATP)
→ keine neue Transkripte die mit gestresste Zelle zu tun haben
GRO-Seq ?
Globalisiertes Run-On and Sequencing
benutzt GRO-Seq radioaktive Markierungen?
Nein
benutzt bromiertes UTPs
GRO-Seq
Ablauf?
Kernisolation & Zugabe von Detergenzien (wie bei Run-On)
Zugabe von bromierte UTPs + normale Nukleotide
Isolierung und Hydrolysierung der RNA
Präzipitation der markierte RNA per Brom-UTP-Antikörper die auf Beads aufgebracht sind
Waschen und Eluieren
Entfernung Kappe & End Reparatur
Library Preparation:
5’Ende MPSS, Illumina 1G Genom Analyzer
GRO-Seq
Was verhindert weitere Initiation?
–> Isolierung + Detergenzien (zB Sarkosyl) verhindert weitere Initiation
GRO-Seq
Library Preparation?
Library Preparation:
- 5’, 3’ Adapter Ligation mittels weitere Bead Binding
- Reverse Transkription, Barcodes usw
- Amplifikation
- PAGE- Aufreinigung
GRO-Seq
Wie wird RNA isoliert und fragmentiert?
zB Ultraschall
GRO-Seq Befunde
An TSS?
Viele Antisense Reads: RNAP feuert in falsche Richtung. Transkripte aber schnell wieder abgebaut
GRO-Seq Befunde
An 3’ Ende?
Nuklease schneidet an Signal-Sequenzen an RNA, dann wird PolyA angehängt
→ deswegen erwartet man ein Scharfes Ende von Reads hier
Aber Polymerasen gehen nach diesem Signal doch weiter, Transkripte werden aber sofort wieder durch Nukleasen abgebaut
→ GRO-Seq Reads vorhanden
GRO-Seq
Genklassen basierend auf RNAP Aktivität, durch GRO-Seq identifiziert
Klasse 1 - nicht pausiert, aktiv:
Durchgehend Signal
Klasse 2 - Pausiert, aktiv:
Nur am Anfang starkes Signal, dann nur noch schwaches SIgnal
Klasse 3 - pausiert, nicht aktiv,
RNAP fängt ab und zu an, aber kommt nicht weiter (pausiert)
kein Protein wird gebildet
Klasse 4 - nicht pausiert, nicht aktiv
Keine pausierte RNAP, gar keine gebundene RNAP
kein Protein wird gebildet
Beispiel fuer Klasse 1 : Gen nicht pausiert, aktiv
Bsp: Gen für ribosomales Protein
Beispiel fuer Klass 2: Gen pausiert, aktiv
Bsp: Gen für Hitzeschockprotein
PRO-Seq?
= Precision nuclear run-on and sequencing
weiterentwicklung von GRO-Seq
PRO-Seq
Ablauf?
(Erste Schritte wie andere Run-Ons)
Hinzugabe biotinmarkierter NTPs → nur 1 NTP eingebaut, RNA Pol stoppt
RNA Isolierung: Pulldown mittels Streptavidin ( extrem hohe Affinität für Biotin)
Library Preparation:
Sequenzierung der 3’ Ende
Adaptersequenz bekannt → man sieht genau wo RNAP gesessen hat
PRO-Seq Vorteil
Aufloesung steigt dramatisch
PRO-Seq Befunde
Exons - Pausieren?
Differentielles Pausieren der RNAP an verschiedenen Exons
Verstärkte Signale in Exons in Vergleich zu Introns - langsamer in Exons
Gilt fuer gut gespleisste Exons - RNAP nicht so stark verlangsamt in weniger benutzte Exons
PRO-Seq Befunde
Pausierungsstellen?
Identifizierung Pausierungstellen der RNAPol an der DNA in der Nähe des Promotors
Wegen Splicing
Möglicherweise Regulation durch Pausieren
PRO-Seq Befunde
Feinkartierung des Promoter-proximalen Pausierens
Was bestimmt Pausierung?
Experiment in Hsp70 promotor
Pausierungssequenzelemente stomab von TSS: Abstand ist wichtig
Pausierungslevel wird durch Einfügung einer Insert Sequenz, in Abhängigkeit der Länge dieser veraendert
Nachteile von GRO- und PRO-Seq
Limitierung: nur in Zellkulturen/artificial Systems (markierte NTPs müssen inkubiert werden)
Artifacts may be introduced during preparation of nuclei (Stress –> andere Transkripte).
Artifact: result ≠ biological material / function, arises from technical, often artificial, process.
Unerwünschte neue Initiationen während Run-On moeglich
NET-Seq ?
= Native Elongating Transcript Sequencing
NET-Seq
Unterschiede zu GRO- PRO-Seq?
Keine Kernisolierung noetig
Keine Markierung noetig
Bestimmt wo genau RNAP transkribiert, ohne Limitierung von PRO-Seq
NET-Seq
Ablauf?
Einfrieren → RNAP läuft nicht weiter
Zelllyse - danach soll keine RNAP Aktivität stattfinden
Nachweis Experiment durch: RNAP Inhibitor alpha-Amanitin→ keine Artefakten
Präzipitation der RNAP-RNA-DNA Komplex
DNA Verdauung
RNA Aufreinigung
Library Generierung
Sequenzierung
NET-Seq Befunde
Introns, PolyA ..?
Detektion von Introns und Regionen stromabwärts von PolyA-Stellen
Vergleich naszierende vs. gereifte mRNA
NET-Seq Befunde
Cryptic Unstable Transcripts
Detektion von “CUTs”
Cryptic Unstable Transcripts (akkumulieren nicht)
Mögliche Grund: Transkription hat einen Einfluss auf Chromatin
NET-Seq Befunde
Pausierungsstellen
Rueckwartsgang
Pausierungsstellen (wie bei PRO-Seq)
Identifikation Pausierungsstellen: ca alle 20 BP pausiert RNAP
Rückwärtsgang: Nach Pausierung gehen RNAP manchmal zurück, versuchen nochmal
3’ Ende muss von Hilfsfaktor abgeschnitten werden, damit RNAP wieder freies katalytisches Zentrum hat und weitermachen kann
Mutation der Hilfsfaktor ändert die Pausierungsstellen → nach rechts verschoben
NET-Seq Befunde
RNAP Modifikationion
Analyse von spezifischen RNAPII Modifikationen mittels NET-Seq
CTD Schwanz: hoch-konservierte repetitive AS-Sequenz: Y1-S2-P3-T4-S5-P6-S7
2 Serine (2 und 5) können phosphoryliert werden
Modifikationsmuster kann sich verändern waehrend Transkription, von Initiation zu Elongation
CTD Modifikationen verändern Eigenschaften der RNAP und ihre Interaktion mit verschiedenen Faktoren
S5P modifizierte RNAPII assoziiert mit dem 3’-Ende von Exons
Bsp TARS Gen mit E9 und E10:
S5P hat Schlüsselrolle: starkes NET-Seq Signal am 3’-Ende des Exons
Transkribiert über exon und intron, wird langsamer in exon, ein bruch entsteht am Ende der vorherige Exon, Exon wird mitgeschleppt von der Pol, obwohl sie schon im 3’ exon ist,
Es gib eine ganze Reihe von Introns die gespleißt werden während noch transkribiert wird
= kotranstriptionelles Spleissen
NET-Seq Befunde
RNAP Modifikationion
Modell von kotranscriptionelles Spleissen
Modell von Ko-Transkriptionellem Spleißen
Neg. Ladung der S5P Phosphatgruppe ermöglicht direkte Rekrutierung von Spleißosom
S5P bremst RNAP, erlaubt Ausführung des 2. Spleißschrittes während 3‘ Exon transkribiert wird
🡪 Pausierungsstellen
(nojima et al)
- Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen
Begriffe erklaeren
Transkription = Transkriptionsaktivität, Transkriptionsrate, Transkription/Zeit
Transkriptionsakkumulation = steady-state Zustand von Transkriptionsmenge
- Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen
Abhaengig von?
Abhaengig von:
Transkription: Polymerase Geschwindigkeit, Transkriptionsinitiationsraten
Transkriptakkumulation: Transkriptionsrate, Transkriptabbau
- Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen
Messung durch?
Messung durch:
Transkription: Run-On, GRO- und PRO-Seq, NET-Seq
Transkriptakkumulation: RNA-Seq misst Transkripte die sich in Zelle befinden
- Nennen Sie Beispiele, warum Transkriptionsrate und Transkriptakkumulation nicht korrelieren müssen
Beispiel
Transkription in 2 Zellen gleich,
Trotzdem kann es unterschiedlich große Transkriptakkumulation geben
- Nennen Sie drei Beispiele für Vorgänge, die ko-transkriptional passieren?
splicing
polyadenylierung
capping
Ladung von Exportfaktoren (aus Zellkern ins Cytosol)
Erkennung von Fehler oder DNA-Schäden, rekrutiert DNA Reparatur-Machinerie
- Warum werden für einen run-on erst Kerne aus Zellen isoliert?
Damit markierte Nukleotide durch die relatven grossen Kernporen in den Kern leicht diffundieren koennen
Metabolite können fast ungehindert durch Kernpore, durch Membranporen nicht so einfach
- Was ist der wesentliche Unterschied zwischen Gro-Seq und Net-Seq?
GRO-Seq:
- Kernisolierung
- Run-On mit markierten NTPS
- limitierte Elongation mit markierten Nukleotiden an isolierten Kernen,
- Präzipitation der RNA anhand der bromierte NTPs
NET-Seq:
- keine Kernisolierung nötig
- Kein Run-On, keine markierte NTPs
- Nachweis Experiment (alpha-Amanitin)
- Präzipitation der Polymerase mit gebundene RNA (und dNA)
- Inwiefern stellt Pro-Seq eine technische Verbesserung gegenüber Gro-Seq dar?
Einzige biotinierter Nukleotid eingebaut - sperrige biotinierte NTP haltet RNAP
RNA Isolierung: Pulldown mittels Streptavidin ( extrem hohe Affinität für Biotin)
→ Hoehere Aufloesung: bestimmt Nukleotid an dem Polymerase stoppt
- Warum stirbt man nach einer Vergiftung mit Knollenblätterpilzen erst nach 1-3 Tagen, mit den ersten Symptomen meist erst nach 24 Stunden?
Inhibitor alpha-Amanitin inhibiert RNAPII → keine Bildung neuer mRNA
mRNA ist noch in Zelle vorhanden aber wird abgebaut
→ Leberschaden
2-Phase Verlauf
- Erste Symptome, dann leckphase, dann Tod
- Erst Magen-Darm-Trakt Beschädigung (1. Phase), dort RNA mit sehr kurzer Halbwertszeit (~1h) -🡪 Bauchschmerzen erbrechen
- Gift wandert durch Blut in Leber 🡪 dort Schädigung, Tod
- Nennen Sie einen technischen Nachteil von Gro-Seq gegenüber Net-Seq.
Limitierung: nur in Zellkulturen/artificial Systems (markierte NTPs müssen inkubiert werden)
Isolation der Kerne Aufwendig
Wegen Stress, andere Transkripte: Artefakten koennen wahrend Kern-Präparation eingebracht werden
Unerwünschte neue Initiationen während Run-On moeglich
- Sie wollen die Transkription in Mitochondrien von HeLa Zellen mittels Gro-Seq messen. Welches Problem müssen Sie lösen?
Mitochondrien haben Doppelmembran mit spezifische Transportproteine
→ sehr selektive Permeabilität
→ es ist schwieriger Nukleotide einzubringen
- Welche Rolle kann die Phosphorylierung der RNA Polymerase II an ihrer C-terminalen Domäne spielen?
CTD Schwanz: hoch-konservierte repetitive AS-Sequenz: Y1-S2-P3-T4-S5-P6-S7
2 Serine (2 und 5) können phosphoryliert werden
Modifikationsmuster kann sich verändern waehrend Transkription, von Initiation zu Elongation
CTD Modifikationen verändern RNAP Eigenschaften, ihre Interaktion mit versch. Faktoren
→ kotranstriptionelles Spleissen:
- Neg. Ladung der S5P Phosphatgruppe ermöglicht direkte Rekrutierung von Spleißosom
- S5P bremst RNAP, erlaubt Ausführung des 2. Spleißschrittes während 3‘ Exon transkribiert wird
🡪 Pausierungsstellen
(nojima et al)
- . Nach einer strangspezifischen Gro-Seq Analyse einer menschlichen Zelllinie erhalten Sie nicht nur erwartete Signale stromab von Promotoren, sondern bei den meisten Promotoren auch reads auf dem Gegenstrang stromauf, bis etwa zur Position -100. Wie interpretieren Sie dieses Ergebnis?
RNA Polyermase werden in falsche Richtung gefeuert → antisense Transcripte
Antisense Transcripte werden schnell abgebaut
( ?? TFIIH: RNAP2 pausiert in Nähe des Promotors, braucht dort weiterer Faktoren zur Änderung Phosphrylierungstatus, erst dann ist sie prozessiert ??)
