VL10 Ribonomics Flashcards
RBP
RNA-binding protein – RNA-BIndeprotein
RBD
RNA-binding domain – RNA-BIndedomäne
IDR
Intrinsically disordered region
RNP - Ribonucleoprotein (= Komplex, bestehend aus RNA(s) and protein(s))
RNP - Ribonucleoprotein (= Komplex, bestehend aus RNA(s) and protein(s))
IP
IP – Immunoprecipitation/ Immunopräzipitation
CLIP
CLIP - Crosslinking and Immunoprecipitation
Vorkommen von RNA in Zelle
- RNA ist in der Zelle nie “nackt“,
- immer in einem Komplex mit Proteinen
- von Proteinen begleitet - teils wie Staffelstab von Protein zu Protein weitergegeben
- RNA liegt in Zelle gefaltet vor
Tissue Specificity score - niedrig?
wie spezial ist die Protein
niedrig - in fast allen Geweben / Zellklassen
hoch - vielleicht nur in einem Zellklasse
Tissue Specificity score - hoch?
wie spezial ist die Protein
hoch - vielleicht nur in einem Zellklasse
zelltyp- spezifische tRNA/rRNA-Binde-Proteine
viel oder wenig?
wenig
zelltyp- hochspezifische mRNA- Binde-proteine (mRBPs)
viele
aber auch viele zelltyp-spezifische
Bindungsarten von Proteinen an RNA
welche?
2:
Über RNA-binde Domänen in Proteinen
Über IDR = intrinsically disordered regions , ohne Bindedomäne
RRM
aufbau?
3 beta-Faltblaetter, 2 alpha-Helices - bindet an RNA
RRM
Beispiele?
zB YxiN - aus Bakterium (Bacillus)
zB Sxl - (sexlethal) aus Drosophila
RRM?
= RNA Recognition Motif
bekannteste, stark konservierte RNA Binde-Domäne in Proteinen
RNA-Binde-Domänen (RBDs)
Beispiele?
RRM - RNA Recognition Motif
Pumilio (Pum1)
Zink Finger
RGG Box
KH Domain, K homology Domain, DEAD-box helicase Domain…..
Pumilio?
RNA-Binde-Domaene (RBD)
aus viele alpha-helices (ca 10)
jede einzelne wirkt als „Finger“ und kann jeweils ein Nukleotid abtasten
Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind
- welche 3 Klassen?
Basische
Polare
Aromatische
Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind
Basische AS
Wie?
Welche AS?
Enden sind + geladen 🡪 passt auf RNA (RNA Rückgrat ist – geladen )
–
Arginin, Lysin, Histidin
Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind
Polare AS
Wie?
Welche AS?
ungeladen
OH-Gruppen am Ende die über Wasserstoffbruecken sich mit den Nukleotiden verknüpfen
–
Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind
Aromatische AS
Wie?
Welche AS?
Benzolring = delokalisiertes pi-Elektronensystem (können Licht absorbieren)
3D-Struktur von Bezolringe ist planar (flach aufm Boden)
→ in der Lage sich zwischen die „Sprossen“ der RNA „Leiter“ zu schieben
–
Tyrosin, Tryptophan
Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung
welche Moeglichkeiten?
1: Sequenzspezifisch
Protein erkennt bestimmte RNA-Sequenzen
mittels Hintereinanderschaltung mehrere Domänen
2: Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA
IRE - iron response element- Hairpin
G quadruplex- Faltung
Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung
sequenzspezifisch - wie?
Sequenzspezifisch:
Protein erkennt bestimmte RNA-Sequenzen
mittels Hintereinanderschaltung mehrere Domänen
Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung
Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA - wie?
Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA
zB:
- IRE - iron response element- Hairpin
- G quadruplex- Faltung
Bindung von RB-Protein an RNA
Komplex - warum?
Vorteile davon?
RB-Proteine binden teils nicht unabhängig voneinander
Kooperativität und multiple Bindungen verkompliziert alles
Bindungen sind Kurzfristiger (vs. bei DNA)
Hochdynamisch
→ in vitro schwer nachmachbar
Vorteil: Höhere Affinität & Möglichkeit aendern Spezifität
RNA-Bindung mittels IDR?
Bindung ohne Domäne
IDR = intrinsically disordered regions
RNA-Bindung mittels IDR
Bsp
Beispiel: hnRNP A1 aus menschlichen Zellen
RNA-Bindung mittels IDR
IDR-Region - wie besonders?
nicht gefaltet
RNA-Bindung mittels IDR
Funktionsweise?
🡪 Proteine bilden Tropfen „blob“
🡪 Proteine sind in den Kügelchen lokalisiert und diffundieren nicht durch Zelle
🡪 in den Tropfen-Region kann Proteine ohne Domänen an RNA binden
Ohne IDR - keine Phasentrennung
IDRs as organising principle for cellular localisation of functional RNPS
RNA wirken auch bei Aufbau und Stabilisierung des Tropfen mit
Liquid-liquid phase seperation – Konzept
Phasentrennung: das Cytosol hat eine andere Dichte als der IDR-Komplex
(wie Honigtropfen in Glas Wasser)
In Tropfen anderes Milieu als in Cytosol- Medium (auch andere pH-Wert möglich)
Methoden und Techniken um individuelle RNPs zu untersuchen
Immer Wechselspiel aus ___- und ___-Methoden
Immer Wechselspiel aus RNA- und Protein-Methoden
Untersuchung individuelle RNP
welche Aufreinigungen
native
denaturierte
Native Aufreinigung
Vorteile / Nachteile?
Vorteile:
Aufreinigung mild 🡪 Originalinteraktionen bleibt erhalten,
Ganzer Komplex bleibt intakt
Nachteile:
Man kann nicht ganze chemie verwenden 🡪 Bindungen instabiler
Native Aufreinigung
Crosslinking?
keine
Native Aufreinigung
Buffer?
muss RNA-Protein Interaktion konservieren:
milde Bedingungen
Denaturierte Aufreinigung
Vor- und Nachteile?
Vorteile:
- so sauber wie möglich
- Bindungen stabil
- weniger Kontamination, weniger Verunreinigung
Nachteile:
- keine Originalinteraktion
Denaturierte Aufreinigung
Crosslinking
mit:
- UV Licht (254nm) oder
- Formaldehyd
Denaturierte Aufreinigung
Buffer?
muss keine RNA-Protein Interaktion konservieren:
- SDS /liDS
- Harnstoff
- viel / kein Salz
- NP40/Triton-X/DTT
Techniken fuer Protein- Analyse
Gel?
SDS-PAGE
Techniken fuer Protein- Analyse
Detektion?
bekannte: Western blot mit Antikörper
unbekannte: Mass Spectrometry
Techniken fuer Protein- Analyse
Aufreinigung?
Immunopräzipitation
mit Antikörper
Techniken fuer RNA- Analyse
Gel?
- PAGE (8M Urea)
- Agarose
Techniken fuer RNA- Analyse
Detektion?
bekannt: Northern blot mit antisense Sonde
quantitativ: q(RT)-PCR
unbekannt: RNA-Seq
Techniken fuer RNA- Analyse
Aufreinigung?
Antisense nucleic acid (Nukleinsäure)
zB oligo d(T)
UV-Crosslinking
Ziel?
Ziel: RNA und Protein sollen fest, kovalent verbunden werden
UV-Crosslinking
Funktioniert bei
nur bei RBPs, die direkt an RNA binden können
Andere Proteine, die frei in der Zelle sind oder an RBP haften, werden nicht gebunden
UV-Crosslinking
Ablauf
Licht regt Nukleo-Basen an
elektronen kommen in Singulett Zustand, wollen jedoch wieder in nicht angeregten Zustand
entweder:
meistens fallen direkt zurueck in ungeregten Zustand → Wärmeabgabe
oder gehen in Triplettzustand → dann Wärmeabgabe
oder:
können von Singulett oder Triplettzustand eine Crosslink mit AS bilden
→ Bildung feste kovalente Bindung
UV-Crosslinking
Wellenlaenge von UV-Licht?
254 nm
UV-Crosslinking
meistens welche Base / welche AS?
Uracil
Cystein
PNK Assay?
Untersucht?
Antwort?
= Polynukleotid-Kinase-Test
Untersuchung: ist Protein ein RNA-Binde-Protein
Ja/Nein-Antwort; keine Aussage über welche RNA gebunden ist
PNK Assay
Protein rausziehen
Labeling von RNA (radioaktiv)
Analyse mit Proteingel → daraus Western blot
Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie
PNK Assay
1 - Protein rausziehen?
Protein rausziehen:
- UV-Crosslink, Kontrolle ohne Crosslink
- Zell-Lyse
- Immunopräzipitation gegen Protein von Interesse
- Ziehen am Protein zieht RNA wegen Crosslink mit
- RNAse Verdau (kleinere Fragmente machens Leben leichter)
PNK Assay
2 - Labeling von RNA
Labeling von RNA
- radioaktives Markieren der RNA
- mittels Poly-Nukleotid-Kinase → macht Nukl einsäuren radioaktiv
PNK Assay
- Analyse mit Proteingel?
Analyse mit Proteingel → daraus Western blot:
- Ohne Crosslink (Negativ-Kontrolle): nur Protein → klare Band
- Mit Crosslink: Protein-Band + Schmier wegen RNA-gebundene-Proteine
- Protein-RNA-Komplex ist größer als nur Protein 🡪 laufen nicht so schnell durch Gel 🡪 weiter oben in Gel angesammelt
PNK Assay
- Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie
Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie:
- Abbildung auf Autoradiographie zeigt radioaktives Signal der markierten RNA
- An gleicher Stelle wo bei Western Blot „RNA-Schmiere“ erkennbar ist, sollte radioaktives Signal sein
CLIP-Seq?
Untersucht?
= cross-linking immunoprecipitation-high-throughput sequencing
Untersuchung: Welche RNAs ist/sind an meinem Protein gebunden
CLIP-Seq
Arbeitsaufwand?
Arbeitsaufwand-Wiederholung Experiment
2+ replikate: Man muss Experiment mind. 2-3-mal machen
jeweils mit ± UV-Crosslink (negativ-Kontrolle)
–> 6 Libraries zum Sequenzieren schicken → 100-150 mio Reads
Verschiedenste Konditionen
Viele GB roher Daten
CLIP-Seq
gleiche erste Schritte wie PNK Assay?
denaturierende Aufreinigung: UV-Crosslink
Zelllyse
RNAase Verdaut RNA (mit riesene RNA kann man nicht arbeiten)
IP: Immunopräzipitation mit Antikörper 🡪 Zielprotein mit RNA rausziehen (bis hier wie bei PNK Assay)
CLIP-Seq
erste Schritte die anders als bei PNK Assay sind
IP dann:
3’ Adapterligation: Ligation von radioaktive-RNA an 3‘ Ende der RNAs (die an Protein hängen)
Gelelektrophorese
Autoradiographie 🡪 radioaktive RNA-Schmiere
Ausschnitt des Radioaktiven Teils aus Gelmembran, hier sind die RBPs enthalten
Aufreinigen des Ausschnittes
Proteinase Verdaut Protein 🡪 lässt nur noch ein kleines Stück Protein am Crosslink an der RNA
bis hier fuer ganzen CLIP-Methoden sehr aehnlich, ab hier verschiedene Wege wie man weitermachen kann
dann Schritte die besonders zu zB PAR-, HITS-, i- CLIP sind.
dann PCR und Sequenzierung
an Crosslink-Stelle macht Polymerase immer einen Fehler
🡪 in Analyse kann Crosslink-Stelle bestimmt werden, bis auf Nukleotid
CLIP-Seq
PAR-/HITS-CLIP
besondere Schritte bei PAR-/HITS-CLIP
PAR-CLIP: Photo-Activatable Ribonucleoside-enhanced CLIP
HITS-CLIP: High-Throughput Sequencing of RNA isolated by CLIP
5‘ Adapterligation, in der Mitte ist unbekannte RNA (3’Ende frühere Adapterligation)
🡪 am 5’Ende und 3‘ End sind bekannte Sequenzen
Reverse Transkription 🡪 Bildung cDNA
iCLIP
reverse Transkription
cDNA bis Crosslink
2. Adapterligation
CRAC
wirklich ???
CRAC: Crosslinking and Analysis of cDNAs - laeuft sehr aehnlich zu CLIP-Seq ab
wirklich ???
RNA interactome capture
Untersucht?
Basiert auf?
Nativ oder denaturierend?
Identifikation der Proteine die an mRNA gebunden sind
Basiert auf: Fast alle mRNAs besitzen einen Poly-A Schwanz
denaturierend
RNA interactome capture
Ablauf?
Ablauf:
- UV-Crosslink
- Zelllyse
- Oligo-dT (braune Kügelchen, ca 25 Ts) binden unspezifisch an Poly-A 🡪 mittels Oligo-dT- an RNA ziehen
- RNase verdaut RNA
- Massenspektrometrie
MS2-tag
Untersucht?
Identifikation aller Proteine die mit einer spezifische RNA binden
MS2-Tag
Ablauf?
Ziel-mRNA verlängern mit MS2-Tag (besteht aus Hairpins)
MS2-Hüllprotein bindet sehr stark an Hairpins von MS2-tag
MS2-Hüllprotein fusioniert mit GST (Glutathione S-transferase)
GST steckt an beads (über Glutathione) → werden rausgezogen
Aufreinigung
Mit GFP/Biotin Markierung
MS2-Tag, MS2-Huellprotein
Stammt aus?
Bacteriophage
MS2-Tag - Nachteil
Nachteile:
MS2-tag ist sehr lang (ca 14) 🡪 sehr viele Hairpins benötigt, damit es effizient wird
Schwierig: Einschleusen von modifizierter RNA in Zelle
Tiling
Problem bei ‘klassischen Pull-Down (antisense-oligo-Sonde): können multiple RNA binden
Lösung - Tiling: viele kleinere antisense oligos, die individuell auf Ziel perfekt passen, komplett bedecken
Fehler verteilt sich
Wurde ChIRP genannt (Chromatin Isolation by RNA purification)
PTex (Phenol Tolul extraction)
Untersucht?
Identifiziert alle RNP von Zelle
PTex (Phenol Tolul extraction)
nativ oder denaturierend
denaturierend
PTex (Phenol Tolul extraction)
basiert auf
Phasentrennung mit Phenol aufgrund Molekültyp
PTex (Phenol Tolul extraction)
Ablauf
Ablauf:
UV-Crosslinking, Zelllyse
Phenol-toluol Phasentrennung: lipide usw weg
acidic Phenol → Phasentrennung
- oben: wässrige Phase - RNA
- Mitte: Übergangsphase - crosslinked Protein+RNA
- unten: organische Phase - Proteine
Weitererarbeitung mit Übergangsphase
