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BXY11 Molekularbiologie > VL10 Ribonomics > Flashcards

VL10 Ribonomics Flashcards

1
Q

RBP

A

RNA-binding protein – RNA-BIndeprotein

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Q

RBD

A

RNA-binding domain – RNA-BIndedomäne

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3
Q

IDR

A

Intrinsically disordered region

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4
Q

RNP - Ribonucleoprotein (= Komplex, bestehend aus RNA(s) and protein(s))

A

RNP - Ribonucleoprotein (= Komplex, bestehend aus RNA(s) and protein(s))

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5
Q

IP

A

IP – Immunoprecipitation/ Immunopräzipitation

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6
Q

CLIP

A

CLIP - Crosslinking and Immunoprecipitation

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7
Q

Vorkommen von RNA in Zelle

A
  • RNA ist in der Zelle nie “nackt“,
  • immer in einem Komplex mit Proteinen
  • von Proteinen begleitet - teils wie Staffelstab von Protein zu Protein weitergegeben
  • RNA liegt in Zelle gefaltet vor
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8
Q

Tissue Specificity score - niedrig?

A

wie spezial ist die Protein

niedrig - in fast allen Geweben / Zellklassen
hoch - vielleicht nur in einem Zellklasse

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9
Q

Tissue Specificity score - hoch?

A

wie spezial ist die Protein

hoch - vielleicht nur in einem Zellklasse

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10
Q

zelltyp- spezifische tRNA/rRNA-Binde-Proteine

viel oder wenig?

A

wenig

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11
Q

zelltyp- hochspezifische mRNA- Binde-proteine (mRBPs)

A

viele

aber auch viele zelltyp-spezifische

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12
Q

Bindungsarten von Proteinen an RNA

welche?

A

2:

Über RNA-binde Domänen in Proteinen

Über IDR = intrinsically disordered regions , ohne Bindedomäne

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13
Q

RRM

aufbau?

A

3 beta-Faltblaetter, 2 alpha-Helices - bindet an RNA

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14
Q

RRM

Beispiele?

A

zB YxiN - aus Bakterium (Bacillus)

zB Sxl - (sexlethal) aus Drosophila

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15
Q

RRM?

A

= RNA Recognition Motif

bekannteste, stark konservierte RNA Binde-Domäne in Proteinen

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16
Q

RNA-Binde-Domänen (RBDs)

Beispiele?

A

RRM - RNA Recognition Motif

Pumilio (Pum1)

Zink Finger

RGG Box

KH Domain, K homology Domain, DEAD-box helicase Domain…..

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17
Q

Pumilio?

A

RNA-Binde-Domaene (RBD)

aus viele alpha-helices (ca 10)

jede einzelne wirkt als „Finger“ und kann jeweils ein Nukleotid abtasten

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18
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

  • welche 3 Klassen?
A

Basische

Polare

Aromatische

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19
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

Basische AS

Wie?
Welche AS?

A

Enden sind + geladen 🡪 passt auf RNA (RNA Rückgrat ist – geladen )

–

Arginin, Lysin, Histidin

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20
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

Polare AS

Wie?
Welche AS?

A

ungeladen

OH-Gruppen am Ende die über Wasserstoffbruecken sich mit den Nukleotiden verknüpfen

–

Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin

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21
Q

Aminosäuren die direkt mit RNA-Bindung involviert sind

Aromatische AS

Wie?
Welche AS?

A

Benzolring = delokalisiertes pi-Elektronensystem (können Licht absorbieren)

3D-Struktur von Bezolringe ist planar (flach aufm Boden)

→ in der Lage sich zwischen die „Sprossen“ der RNA „Leiter“ zu schieben

–

Tyrosin, Tryptophan

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22
Q

Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung

welche Moeglichkeiten?

A

1: Sequenzspezifisch
Protein erkennt bestimmte RNA-Sequenzen
mittels Hintereinanderschaltung mehrere Domänen
2: Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA
IRE - iron response element- Hairpin
G quadruplex- Faltung

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23
Q

Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung

sequenzspezifisch - wie?

A

Sequenzspezifisch:

Protein erkennt bestimmte RNA-Sequenzen

mittels Hintereinanderschaltung mehrere Domänen

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24
Q

Erkennungsmerkmale an RNA für Proteinbindung

Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA - wie?

A

Protein erkennt Sekundärstruktur der RNA

zB:

  • IRE - iron response element- Hairpin
  • G quadruplex- Faltung
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25
Q

Bindung von RB-Protein an RNA

Komplex - warum?

Vorteile davon?

A

RB-Proteine binden teils nicht unabhängig voneinander

Kooperativität und multiple Bindungen verkompliziert alles

Bindungen sind Kurzfristiger (vs. bei DNA)

Hochdynamisch

→ in vitro schwer nachmachbar

Vorteil: Höhere Affinität & Möglichkeit aendern Spezifität

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26
Q

RNA-Bindung mittels IDR?

A

Bindung ohne Domäne

IDR = intrinsically disordered regions

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27
Q

RNA-Bindung mittels IDR

Bsp

A

Beispiel: hnRNP A1 aus menschlichen Zellen

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28
Q

RNA-Bindung mittels IDR

IDR-Region - wie besonders?

A

nicht gefaltet

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29
Q

RNA-Bindung mittels IDR

Funktionsweise?

A

🡪 Proteine bilden Tropfen „blob“
🡪 Proteine sind in den Kügelchen lokalisiert und diffundieren nicht durch Zelle
🡪 in den Tropfen-Region kann Proteine ohne Domänen an RNA binden
Ohne IDR - keine Phasentrennung

IDRs as organising principle for cellular localisation of functional RNPS

RNA wirken auch bei Aufbau und Stabilisierung des Tropfen mit

30
Q

Liquid-liquid phase seperation – Konzept

A

Phasentrennung: das Cytosol hat eine andere Dichte als der IDR-Komplex
(wie Honigtropfen in Glas Wasser)
In Tropfen anderes Milieu als in Cytosol- Medium (auch andere pH-Wert möglich)

31
Q

Methoden und Techniken um individuelle RNPs zu untersuchen

Immer Wechselspiel aus ___- und ___-Methoden

A

Immer Wechselspiel aus RNA- und Protein-Methoden

32
Q

Untersuchung individuelle RNP

welche Aufreinigungen

A

native

denaturierte

33
Q

Native Aufreinigung

Vorteile / Nachteile?

A

Vorteile:
Aufreinigung mild 🡪 Originalinteraktionen bleibt erhalten,
Ganzer Komplex bleibt intakt

Nachteile:
Man kann nicht ganze chemie verwenden 🡪 Bindungen instabiler

34
Q

Native Aufreinigung

Crosslinking?

A

keine

35
Q

Native Aufreinigung

Buffer?

A

muss RNA-Protein Interaktion konservieren:

milde Bedingungen

36
Q

Denaturierte Aufreinigung

Vor- und Nachteile?

A

Vorteile:

  • so sauber wie möglich
  • Bindungen stabil
  • weniger Kontamination, weniger Verunreinigung

Nachteile:
- keine Originalinteraktion

37
Q

Denaturierte Aufreinigung

Crosslinking

A

mit:

  • UV Licht (254nm) oder
  • Formaldehyd
38
Q

Denaturierte Aufreinigung

Buffer?

A

muss keine RNA-Protein Interaktion konservieren:

  • SDS /liDS
  • Harnstoff
  • viel / kein Salz
  • NP40/Triton-X/DTT
39
Q

Techniken fuer Protein- Analyse

Gel?

A

SDS-PAGE

40
Q

Techniken fuer Protein- Analyse

Detektion?

A

bekannte: Western blot mit Antikörper
unbekannte: Mass Spectrometry

41
Q

Techniken fuer Protein- Analyse

Aufreinigung?

A

Immunopräzipitation

mit Antikörper

42
Q

Techniken fuer RNA- Analyse

Gel?

A
  • PAGE (8M Urea)

- Agarose

43
Q

Techniken fuer RNA- Analyse

Detektion?

A

bekannt: Northern blot mit antisense Sonde
quantitativ: q(RT)-PCR
unbekannt: RNA-Seq

44
Q

Techniken fuer RNA- Analyse

Aufreinigung?

A

Antisense nucleic acid (Nukleinsäure)

zB oligo d(T)

45
Q

UV-Crosslinking

Ziel?

A

Ziel: RNA und Protein sollen fest, kovalent verbunden werden

46
Q

UV-Crosslinking

Funktioniert bei

A

nur bei RBPs, die direkt an RNA binden können

Andere Proteine, die frei in der Zelle sind oder an RBP haften, werden nicht gebunden

47
Q

UV-Crosslinking

Ablauf

A

Licht regt Nukleo-Basen an

elektronen kommen in Singulett Zustand, wollen jedoch wieder in nicht angeregten Zustand

entweder:
meistens fallen direkt zurueck in ungeregten Zustand → Wärmeabgabe
oder gehen in Triplettzustand → dann Wärmeabgabe

oder:
können von Singulett oder Triplettzustand eine Crosslink mit AS bilden
→ Bildung feste kovalente Bindung

48
Q

UV-Crosslinking

Wellenlaenge von UV-Licht?

A

254 nm

49
Q

UV-Crosslinking

meistens welche Base / welche AS?

A

Uracil

Cystein

50
Q

PNK Assay?

Untersucht?

Antwort?

A

= Polynukleotid-Kinase-Test

Untersuchung: ist Protein ein RNA-Binde-Protein

Ja/Nein-Antwort; keine Aussage über welche RNA gebunden ist

51
Q

PNK Assay

A

Protein rausziehen

Labeling von RNA (radioaktiv)

Analyse mit Proteingel → daraus Western blot

Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie

52
Q

PNK Assay

1 - Protein rausziehen?

A

Protein rausziehen:

  • UV-Crosslink, Kontrolle ohne Crosslink
  • Zell-Lyse
  • Immunopräzipitation gegen Protein von Interesse
  • Ziehen am Protein zieht RNA wegen Crosslink mit
  • RNAse Verdau (kleinere Fragmente machens Leben leichter)
53
Q

PNK Assay

2 - Labeling von RNA

A

Labeling von RNA

  • radioaktives Markieren der RNA
  • mittels Poly-Nukleotid-Kinase → macht Nukl einsäuren radioaktiv
54
Q

PNK Assay

  1. Analyse mit Proteingel?
A

Analyse mit Proteingel → daraus Western blot:

  • Ohne Crosslink (Negativ-Kontrolle): nur Protein → klare Band
  • Mit Crosslink: Protein-Band + Schmier wegen RNA-gebundene-Proteine
  • Protein-RNA-Komplex ist größer als nur Protein 🡪 laufen nicht so schnell durch Gel 🡪 weiter oben in Gel angesammelt
55
Q

PNK Assay

  1. Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie
A

Überprüfung RNA-Signal mittels Autoradiographie:

  • Abbildung auf Autoradiographie zeigt radioaktives Signal der markierten RNA
  • An gleicher Stelle wo bei Western Blot „RNA-Schmiere“ erkennbar ist, sollte radioaktives Signal sein
56
Q

CLIP-Seq?

Untersucht?

A

= cross-linking immunoprecipitation-high-throughput sequencing
Untersuchung: Welche RNAs ist/sind an meinem Protein gebunden

57
Q

CLIP-Seq

Arbeitsaufwand?

A

Arbeitsaufwand-Wiederholung Experiment

2+ replikate: Man muss Experiment mind. 2-3-mal machen

jeweils mit ± UV-Crosslink (negativ-Kontrolle)

–> 6 Libraries zum Sequenzieren schicken → 100-150 mio Reads

Verschiedenste Konditionen

Viele GB roher Daten

58
Q

CLIP-Seq

gleiche erste Schritte wie PNK Assay?

A

denaturierende Aufreinigung: UV-Crosslink
Zelllyse
RNAase Verdaut RNA (mit riesene RNA kann man nicht arbeiten)
IP: Immunopräzipitation mit Antikörper 🡪 Zielprotein mit RNA rausziehen (bis hier wie bei PNK Assay)

59
Q

CLIP-Seq

erste Schritte die anders als bei PNK Assay sind

A

IP dann:

3’ Adapterligation: Ligation von radioaktive-RNA an 3‘ Ende der RNAs (die an Protein hängen)
Gelelektrophorese
Autoradiographie 🡪 radioaktive RNA-Schmiere
Ausschnitt des Radioaktiven Teils aus Gelmembran, hier sind die RBPs enthalten
Aufreinigen des Ausschnittes
Proteinase Verdaut Protein 🡪 lässt nur noch ein kleines Stück Protein am Crosslink an der RNA
bis hier fuer ganzen CLIP-Methoden sehr aehnlich, ab hier verschiedene Wege wie man weitermachen kann

dann Schritte die besonders zu zB PAR-, HITS-, i- CLIP sind.

dann PCR und Sequenzierung
an Crosslink-Stelle macht Polymerase immer einen Fehler
🡪 in Analyse kann Crosslink-Stelle bestimmt werden, bis auf Nukleotid

60
Q

CLIP-Seq

PAR-/HITS-CLIP

A

besondere Schritte bei PAR-/HITS-CLIP

PAR-CLIP: Photo-Activatable Ribonucleoside-enhanced CLIP
HITS-CLIP: High-Throughput Sequencing of RNA isolated by CLIP

5‘ Adapterligation, in der Mitte ist unbekannte RNA (3’Ende frühere Adapterligation)
🡪 am 5’Ende und 3‘ End sind bekannte Sequenzen
Reverse Transkription 🡪 Bildung cDNA

iCLIP
reverse Transkription
cDNA bis Crosslink
2. Adapterligation

61
Q

CRAC

wirklich ???

A

CRAC: Crosslinking and Analysis of cDNAs - laeuft sehr aehnlich zu CLIP-Seq ab

wirklich ???

62
Q

RNA interactome capture

Untersucht?

Basiert auf?

Nativ oder denaturierend?

A

Identifikation der Proteine die an mRNA gebunden sind

Basiert auf: Fast alle mRNAs besitzen einen Poly-A Schwanz

denaturierend

63
Q

RNA interactome capture

Ablauf?

A

Ablauf:

  • UV-Crosslink
  • Zelllyse
  • Oligo-dT (braune Kügelchen, ca 25 Ts) binden unspezifisch an Poly-A 🡪 mittels Oligo-dT- an RNA ziehen
  • RNase verdaut RNA
  • Massenspektrometrie
64
Q

MS2-tag

Untersucht?

A

Identifikation aller Proteine die mit einer spezifische RNA binden

65
Q

MS2-Tag

Ablauf?

A

Ziel-mRNA verlängern mit MS2-Tag (besteht aus Hairpins)

MS2-Hüllprotein bindet sehr stark an Hairpins von MS2-tag

MS2-Hüllprotein fusioniert mit GST (Glutathione S-transferase)

GST steckt an beads (über Glutathione) → werden rausgezogen

Aufreinigung

Mit GFP/Biotin Markierung

66
Q

MS2-Tag, MS2-Huellprotein

Stammt aus?

A

Bacteriophage

67
Q

MS2-Tag - Nachteil

A

Nachteile:

MS2-tag ist sehr lang (ca 14) 🡪 sehr viele Hairpins benötigt, damit es effizient wird

Schwierig: Einschleusen von modifizierter RNA in Zelle

68
Q

Tiling

A

Problem bei ‘klassischen Pull-Down (antisense-oligo-Sonde): können multiple RNA binden

Lösung - Tiling: viele kleinere antisense oligos, die individuell auf Ziel perfekt passen, komplett bedecken

Fehler verteilt sich

Wurde ChIRP genannt (Chromatin Isolation by RNA purification)

69
Q

PTex (Phenol Tolul extraction)

Untersucht?

A

Identifiziert alle RNP von Zelle

70
Q

PTex (Phenol Tolul extraction)

nativ oder denaturierend

A

denaturierend

71
Q

PTex (Phenol Tolul extraction)

basiert auf

A

Phasentrennung mit Phenol aufgrund Molekültyp

72
Q

PTex (Phenol Tolul extraction)

Ablauf

A

Ablauf:

UV-Crosslinking, Zelllyse

Phenol-toluol Phasentrennung: lipide usw weg
acidic Phenol → Phasentrennung
- oben: wässrige Phase - RNA
- Mitte: Übergangsphase - crosslinked Protein+RNA
- unten: organische Phase - Proteine

Weitererarbeitung mit Übergangsphase

BXY11 Molekularbiologie (10 decks)

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