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BXY11 Molekularbiologie > VL6 ChIP-Seq > Flashcards

VL6 ChIP-Seq Flashcards

1
Q

ChIP-Seq Ziel

A

Ziel:

Isolierung und Bestimmung Protein-verpackter-DNA

Protein-DNA-Interaktionen wichtig für Regulierung Genexpression

Wie kann man den “histone code” ablesen?

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2
Q

Histonmodifikation:

Meistens wo auf Protein?

Wann?

Bedeutungen oder Auswirkungen

A

N-Terminal

posttranslational

Bedeutung / Ausiwirkung:
→ Werden jeweils mehr oder weniger „klebrig“
→ Nukleosomen interagieren anders miteinander oder mit anderen Faktoren
→ anderen (Transkriptions)Faktoren werden rekrutiert

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3
Q

Histone Code?

A

hypothesis that transcription of genetic information encoded in DNA is part regulated by chemical modifications to histone proteins

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4
Q

Haeufigste Histonmodificationen

+ an welche AS?

+ Ergebnis?

A

Methylierungen: Lysin (K), Arginin (R) → kondensiert Chromosomen

Acetylierungen: Lysin (K) → lockert Chromosom🡪 hohere Genaktivität

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5
Q

Weniger haeufige Histonmodificationen

A

Ubiquitinylierungen

Serinphosphorylierungen

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6
Q

4 Standard Histone

A

H3
H4
H2A
H2B

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7
Q

ChIP?

A

ChIP = Chromatin Immuno Präzipitation (ChIP)

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8
Q

ChIP:

Anschließende mögliche Experimente

A

Sequenzierung (ChIP-Seq)

Hybridisierung meist auf tiling array (ChIP-chip)

PCR /qPCR

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9
Q

ChIP:

wichtige Zielproteine

A

Transkriptionsfaktoren

Histone (verschiedene Typen und Modifikationen)

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10
Q

ChIP-Seq:

grobe Ablauf

A

Crosslinking mit Formaldehyd

Zelllyse

Ultraschallbehandlung (oder Enzymbehandlung)

Immunopräzipitation (IP)

Eluierung

Reversion des Crosslinks durch hohe Temperaturen
(nur bei DNA)

DNA-Aufreinigung

Sequenzierung

Mapping und peak Identifikation

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11
Q

ChIP Ablauf:

Teilschritt 1:

Crosslinking

A

Crosslinking mit Formaldehyd
Formaldehyd:
- toxisch, krebserregend, vernetzt Proteine mit DNA → Mutationen
- Vernetzung von DNA und Proteinen (für Erhaltung labile Interaktionen)

Wie:
Formaldehyd reagiert mit (Aminogruppe der) Proteine
→ Schiffsche Base (Aminogruppe mit Rest)
→ reaktiv mit Aminogruppen der DNA (befinden sich in Basen)
→ kovalente Bindung von Protein an DNA

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12
Q

ChIP Ablauf:

Teilschritt 3:

Ultrschalbehandlung (oder Enzymbehandlung)

A

Zerstörung DNA

Verkürzung der Chromatinfragmente

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13
Q

ChIP Ablauf:

Teilschritt 4:

Immunopraezipitation (IP)

A

Immunopräzipitation (IP)

  1. Weg: Epitop-tag + Antikörper
    - Epitop-tag (HA, myc - transgen)
    - vor der Lyse markieren
  2. Weg: nur Antikörper
    - Antikörper direkt gegen Protein (bzw. RNA-Pol)
    - Bsp. aus Hasen gewonnen

Antikörper auf Beads geladen

Proteine bindet an Antikörper

Beads koennen Leicht mit Zentrifugation angereicht werden 🡪 Pellet

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14
Q

ChIP

IP - Bspiele von Epitope Tag

A

zB HA - 7 AS, aus hemagglutinin Protein von Influenza
zB myc - 9 AS, aus TF
Antikörper bindet an Tag

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15
Q

ChIP :

Kurzerer reads ermoeglichen _____ _______

A

Kurzerer reads ermoeglichen höhere Auflösung

man weiss besser wo Bindestelle war

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16
Q

ChIP Ablauf:

Schritte nach IP

A 
Eluierung 
Reversion des Crosslinks durch hohe Temperaturen (nur bei DNA)
DNA-Aufreinigung
Sequenzierung
Mapping und peak Identifizierung
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17
Q

ChIP :

DNA Library Anfertigung - Illumina

A

Vorbereitung der kleinen DNA-Fragmente (End-repair ChIP DNA, add one „A“ nt)

Adapterligation: Adapter / Linker mit Barcode - spezifisch fuer jede Library - Barcode erlaubt multiplexing

PCR Amplifikation (16-17 Zyklen)

Library Sequenzierung

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18
Q

Multiplexing

A

PCR, Sequenzierung von verschiedene DNA Libraries gleichzeitig

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19
Q

Kontrollen für ChIP-Seq

A

Kontrollen für ChIP-Seq :

  • Input DNA - Chromatin ohne IP
  • Kein Antikörper / unspezifische Antikoerper (zB Immunoglobulin G - IgG)
  • Kein Tag/ no tag
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20
Q

Kontrollen für ChIP-Seq

Input DNA - wie / warum?

A

Input DNA - Chromatin ohne IP - alles sequenzieren

weil: Fragmente ligieren unterschiedlich gut mit Adaptoren, werden unterschiedlich gut amplifiziert
wie: alles sequenzieren um potentiellen Bias in der Sequenzierfaehigkeit aufzudecken

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21
Q

Kontrollen für ChIP-Seq

Kein Antikoerper / Tag

warum?

A

DNA + Proteine reagieren auch unspezifisch miteinander; Chromatinfragmente kleben auch an Beads

→ Trotz keiner Verwendung von Antikörper, DNA im Pellet

Also, fuer Sichtbarmachung des unspezifischen DNA Hintergrunds in Sequenzierung

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22
Q

Chip-seq bioinformatische Analyse Workflow

A

Reads als FASTQ Datei

Qualitätskontrolle der Sequenzen (Sequenzlänge, Basenzusammensetzung usw)

Mapping: Reads einem Ort im Reference-Genom zuordnen,

Coverage: wie häufig ein Fragment repräsentiert ist

Peak Calling: Normalisierung mit Ausschluss Peaks

Custom Analysis: wo findet man die Peaks, an welcher Stelle im Genom die meisten Reads

  • Enriched Motifs
  • Annotation
  • Overlapping or differentially bound peaks
23
Q

Chip-seq Detektion

A

Chip-seq Detektion - siehe ZF

ChIP-Seq eines TFs
Identifizierung von ChIP-Peaks basierend auf typischer Asymmetrie der Sequenzier-reads
Sequenzierung von Reads auf + und - Strang jeweils von 5’Richtung in 3’Richtung
🡪 Reads in beide Richtungen

ChIP-Seq mehrerer TFs
Bindung von mehreren TFs 
führt zu ungenauer Peak-Detektion 🡪 schlechtere Auflösung
Uberlapp der Gauss-Verteilung
nicht ungewoehnlich

ChIP-Seq ausgewaehlter Histonmodifikationen
Fehlende Strand- asymmetrie bei diffusen Histonmodifikationen
ueber groessere Bereicher verteilt - noch ungenauerer Peak

24
Q

Chip-Seq - Moeglichkeiten fuer Kartierung von Bindestellen

A

d = durchschnittliche Fragmentlänge

  1. Möglichkeit - mittels Tag-Verschiebung
    Jeder Sequenz-Tag wird um d/2 verschoben (also zur Mitte des IP-Fragmentes)
  2. Möglichkeit - mittels Tag-Verlängerung
    Jeder Sequenz-Tag wird informatisch in 3‘-Richtung auf d verlängert
25
Normalisierung: andere Name
Normalisierung: Bestimmung des Hintergrunds/ Noise per Input-Analyse/ mock IP-Analyse / P-Calling/ Peak-Calling
26
Warum sind input / mock IP-Daten essentiell?
Noise ist nicht uniform (Chromatin Konformationen, Sequenzierbias, mappability) eigentliches Experiment (= signal + noise) und Input (= noise) haben normalerweise nicht gleiche Sequenztiefe
27
Normalisierung - Ansatz bei RNA-Seq funktioniert das bei ChIP-Seq?
naiver Ansatz: Skalierungsfaktor (funktioniert bei RNA-Seq) Input: N Reads Experiment → M > N reads Normalisierung an Hand der Größe der Library: M → M’ = N
28
ChIP-Seq: Experiment mit Negativ-Kontrolle Wie macht man Normalisierung?
Problem: Signal beeinflusst scaling Faktor: mehr Signal aber gleicher Noise → Normalisierung an Hand Librarygröße → künstlicher Noise überbewertet Lösung: Peak Calling; Ausschluss von Regionen mit starker Anreicherung → Skalierung der beiden Experiment basierende nur auf technischen Unterschieden (vereinfacht - tatsaechlich nach partieller Regression)
29
ChIP-Seq: Vergleichenden ChIP-Seq Experimenten Wie macht man Normalisierung?
Differentielle Anreicherung bei Vergleichenden ChIP-Seq Experimenten Meist werden mehrere Chip-Seq-Experimente verglichen 🡪 ChIP-Seq unter verschiedenen Bedingungen Dann kann man mit einer einfacher Skalierungsfaktor wie bei RNA-Seq Normalisieren Was sind differentiell angereicherte Regionen? In welchen Regionen unterscheiden sich Peaks? Anwendung: Histonmodifikationen DNA-Methylierung
30
TSS
TSS = Transcription Start Site - Wo Pol anfängt - in Promotor zu finden
31
Promotor
Promotor - rekrutiert Pol - enthält TSS
32
Enhancer
Enhancer: wird nicht transkribiert, Bindet Transkriptionsaktivatoren, kann weit von Gen entfernt sein
33
Wie analysiert man Peaks von ChIP-Seq?
Analyse von ChIpPeak: Peaks 🡪 Gene 🡪 Funktionen: Ort des Peaks im Genom? Gibt es genomweit eine Anreicherung von bestimmten Genfunktionen (e.g. GO Kategorien) um die peaks Überrepräsentierte Motive Finden – kmers/logos Clustering mit anderen vorher schon untersuchten DNA-Bindeproteinen Konservierung in Evolution bestimmen
34
Wie analysiert man Peaks von ChIP-Seq? Ort des Peaks im Genom?
Ort des Peaks im Genom? Proximal (stromaufwaerts) zum TSS / Promoter / Enhancer intergenische Region Introns
35
Wie analysiert man Peaks von ChIP-Seq: Nachteile bei Fokus auf proximale Regionen?
Nachteil 1: führt zum Verlust von einer großen Zahl von Bindestellen nicht nur die nächstliegende Gene wo Protein gebunden wurde wird beeinflusst durch Protein Nachteil 2: „Nächstes-Gen“ Ansatz induziert Bias hin zu Genen mit großen Intergenischen Bereichen Manche Gene haben riesige intergenische Bereich e.g. GO-Term "multicellular organism development": 14% aller Gene, aber 33% des Genoms → grosse regulatorische Sequenzen (zB in vgl rRNA) 🡪 auf solche Bereiche findet man ChIP-Peaks
36
Verwandte Techniken zu ChIp-Seq meist _________ Beispiele
meist unspezifischer Beispiele: DNase I hypersensitive site mapping (aelteste Technik) FAIRE-Seq ATAC-Seq 3C - Chromatin Conformation Capture
37
Verwandte Techniken zu ChIp-Seq: DNase I hypersensitive site mapping
welche DNA ist nicht in Nukleosomen gewickelt, d.h. liegt frei vor Unspezifische DNA-Endonuklease - kann nicht in Nukleosom-Bereichen schneiden - kann in TF-Bereichen Schneiden Ergebnis: DNA die nicht mehr da ist, war freie aktive DNA (nicht um Nukleosomen gewickelt) --> Sequenzieren heutzutage: man benutzt MNase - noch aktiver
38
Verwandte Techniken zu ChIp-Seq: FAIRE-Seq
= Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements Ziel: welche DNA ist nicht in Nukleosomen gewickelt (freie DNA) Ablauf - Crosslinking von Proteine mit DNA, mittels Formaldehyd - Zusätzlich Negativkontrolle (ohne crosslink) - Zelllyse, Fragmentierung durch Ultraschall - Phenol/Chloroform Extraction - - oben: Freie DNA/ Nukleotide in wässrige Phase - - unten: Proteine (mit angehefteter DNA) in phenolische Phase - Ergebnis: Sequenzierung von wässrigen Phasen (nicht gecrosslinked, freie DNA), Vergleich mit nicht-crosslinked- Experiment Vorteil: leicht in lebendige Organismen einführbar
39
Verwandte Techniken zu ChIp-Seq: ATAC-Seq
= Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing Ziel: welche DNA ist nicht in Nukleosomen gewickelt (Freie DNA) Basiert auf: transgene, aggressiver Transposase Tn5 / Transposon Schneidet in jeder beliebige freien Stelle der DNA, DNA Fragmente anhängen Transposon trägt Sequenz für Transposase Transposon hat invertierte repetitive (IR) Endsequenzen (die sind auch Zielsequenzen der Transposase) Transposase schneidet Sequenz als Ringförmige Struktur aus erhält nur noch Endsequenzen ohne innere Sequenz Schneidet Gen an vielen Stellen auf (wo DNA offen vorliegt) und klebt an Enden Adapter (für Illumina) dran Ergebnis: Sequenzierung von DNA, die locker verpackt ist
40
Verwandte Techniken zu ChIp-Seq: 3C
3C - Chromatin Conformation Capture Ziel: 3D Struktur DNA/Chromatin im Zellkern zu bestimmen 🡪Welche Gene nah beieinander liegen Ablauf: - Crosslink diesmal um DNA mit anderen DNA-bereichen zu verknüpfen - Schneiden und digestion - Verdauung - Anschließend auflösen des Crosslinks → zirkuläres Molekül - Man benutzt primer für den bekannten Bereich → man kann unbekannte interagierende Sequenz amplifizieren Erkennt Genpositionen, Rückschlüsse auf Interaktionen - zB Enhancer Auch Genomweit möglich (dann braucht man Adaptoren usw) = Hi-C
41
ENCODE
ENCODE Projekt: ChIp-Seq- Anwendung Dutzende Labore haben ChIP-seq unter den gleichen Qualitätsrichtlinien durchgeführt: - Über 100 Transkriptionsfaktoren und Histonmodifikationen wurden getestet - Zusätzliche Techniken für DNA methylation, Chromatin Zugänglichleit, etc.
42
2. Auf welche Bereiche wird in einem ChIP-Seq Experiment bevorzugt normalisiert?
Bereiche zwischen Signal-Peaks im Experiment = Peak Calling - Ausschluss von Regionen mit starker Signalen
43
3. Nennen Sie drei wichtige Kontrollen für ChIP-Seq Experimente.
Input DNA, Kein Antikoerper, kein Tag
44
4. Welchen Zelltyp brauchen Sie für die Durchführung eines ChIP-Seq Experiment? Muskelzelle Nervenzelle B-Zelle: für Antikörper Epidermiszelle
C. B-zelle für die Antikörper (Zelle für Produktion der notwendigen Bestandteilen)
45
5. Welches der folgenden DNA-Bindeproteine interagiert sequenzspezifisch mit DNA? Histon H3 DNA-Polymerase NF-kB RNA-Polymerase
C) NF-kB ist ein Transkriptionsfaktor, der an eine spezifische DNA-Sequenz dem κB-Motiv bindet und so die Transkription beeinflussen kann nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells
46
6. Was ist der primäre Zweck der Ultraschallbehandlung in einem ChIP Experiment? A. Verkürzung der Chromatinfragmente B. Aufschmelzen von dsDNA zu ssDNA C. Die Viskosität in der Probe zu erniedrigen D. Proteine von der DNA zu entfernen
A. Verkürzung der Chromatinfragmente, zerhacken der DNA Hoehere Aufloesung --> Notwendig um Bindestellen zu finden
47
7. Sie wollen genomweit untersuchen, welche Sequenzen von Ihrem Transkriptionsfaktor Bollocks1 gebunden werden. Leider haben Sie momentan keinen Zugang zu einer Sequenziermaschine, sondern müssen präzipitierte DNA mit einem microarray analysieren. Welchen Nachteil hat das?
erfordert Spezies/ transkript spezifische Proben erkennt keine vorher unbekannten Veränderungen Niedrigere Spezifität und Sensitivität dynamic Range - limitierte Auflösung, hängt von DNA-Fragmentlänge ab
48
7. Was bedeutet 3C (mit Skizze) und welche Frage beantwortet dieses Experiment?
Chromatin Conformation Capture Chromatin 3D / räumliche Struktur im Zellkern wird bestimmt quantifizierung von Wechselwirkungen genomischer Loci die sich im 3Dimensionalen Raum nah beieinander befinden, auf dem Genom aber weit entfernt sind Skizze: X, Ring usw
49
8. Wieso sind ChIP-Seq reads oft neben (stromauf-und stromabwärts) und nicht auf der Bindestelle des untersuchten DNA-Bindeproteins zu finden?
Fragmente ca 100basenpaare Alle Fragemnete haben gemein das Bidnestelle für TF im Inneren liegt Bei Sequenzierung mit Illumina nur sehr kurze Reads Reads liegen am Ende der Fragmente (nihct wo gebunden wird
50
Wie kann man mit Formaldehyd global nach regulatorischen Sequenzen im Genom suchen?
FAIRE-Seq Ziel: welche DNA ist frei, nicht in Nukleosomen gewickelt (freie DNA) Ablauf Crosslinking mittels Formaldehyd Proteine mit DNA Zusätzlich Negativkontrolle (ohne crosslink) Zelllyse, Fragmentierung durch Ultraschall Phenol/Chloroform Extraction: - oben: Freie DNA/ Nukleotide in wässrige Phase - unten: Proteine (mit angehefteter DNA) in phenolische Phase Ergebnis: Sequenzierung von wässrigen Phasen (nicht gecrosslinked, freie DNA), Vergleich mit nicht-crosslinked- Experiment
51
10. Was ist der Vorteil von Fair-Seq gegenüber der DNase I Analyse?
DNA1: schneidet DNA Bereiche für die DNAse (ist eine Endonuklease) zugänglich ist 🡪 es entsteht Ende, an das Linker angehängt wird, diese werden sequenziert (diese Bereiche sind zugänglich) FAIRE-Seq: Vorteil in lebendigen Systemen: Formaledhyd leichter aufnehmbar als DNAase 1 (für DNAse 1 müssen Löchr in ZellMembran schaffen, diffundiert in Kern; man muss mit Zelllinien arbeiten)
52
(12.In welchen Regionen des Genoms finden Sie üblicherweise ChIP-Peaks?)
Meist in der Nähe von Promotoren, also um den Transkriptionsstart TSS herum und distale (= enhancer) Region
53
(13.Nennen Sie zwei Techniken, um nicht von Proteinen geschützte DNA-Bereiche zu identifizieren.)
FAIRE-Seq ATAC-Seq DNAseI alles was übrig bleibt war offen, veraltet

BXY11 Molekularbiologie (10 decks)

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