VL 4 - 6

Question 1

Rekombinante DNA

Answer 1

neues DNA molekül

- durch Kombination nicht homologer DNA Fragmente entstanden

Question 2

Gentechnisch veränderter Organismus

Answer 2

Organismus enthält DNA Sequenz eines anderen Organismus, wurde nicht durch Kreuzung hergestellt

Question 3

Markierung von DNA

Answer 3

• durch DNAse1 werde Teilstücke entfernt
• DNA-pl1 fügt markierte nucleotide ein
  –>random priming
• modifizierte Nukleotide können durch Antikörper erkannt werden, immunologisch nachgewiesen oder über Komplexbildung mit anderen Makromolekülen

Question 4

Isolierung mRNA und cDNA Synthese

Answer 4

• Inaktivierung von RNAsen (da sehr labil)
• aufreinigen von mRNA durch poly-dT-Oligo (bindet an Poly-A-Schwanz)
• umschreiben zu cDNA mit reverser Transkriptase (DNA ohne Introns)

Question 5

DNA Klonierung

Answer 5

Einführen eines DNA-Abschnitts in ein geeignetes Vehikel (Vektor)

1. Restriktionsenzyme: schneiden an definierter Sequenz
2. Vektoren : Vehikel, mit dessen Hilfe DNA in Wirtszelle gebracht wird

Question 6

Restriktionsenzyme 1. Klasse

Answer 6

Erkennungssequenz 15bp

• nur ersten und letzten 3 wichtig
• spaltet unbezifisch ca. 1000 bp in 3’ Richtung

Question 7

Restriktionsenzyme 2. Klasse

Answer 7

• Schneiden innerhalb palendromischer Sequent
• Schneiden oft zwischen gleichen Basen (sticky ends)
• oder ohne Überhänge (Blunt ends)

Question 8

Restriktionsenzyme 3. Klasse

Answer 8

• schneiden in definierten Abstand zur Erkennungssequenz

Question 9

Vektoren Eigenschaften

Answer 9

• aufnähme fremder DNA
• autonome Vermehrung in Wirtszelle
• oft mit Antibiotikum-Resistenzgen
• wird je nach DNA-Sample-Größe gewählt

Question 10

Plasmide

Answer 10

Replikationsurprung

• hat Resistenzgene
• Multiple Cloning Site -> dort wird Wunsch-DNA einkloniert

Question 11

gerichtete Klonierung

Answer 11

Vektor und Insert werden mit 2unterschiedlichen Restiktionsenzymen behandelt bzw. linearisiert

Question 12

ungerichtete Klonierung

Answer 12

• beide mit einem RE behandelt
• beide Enten von Insert und Vektor sind kompatibel
• > Gen kann Falschrum eingelagert werden

Question 13

Ziel genetischer Analyse

Answer 13

Function der Proteine: Welche Proteine sind an welche Prozessen beteiligt ?

Question 14

Forwards Genetics

Answer 14

• WT nehmen und durch Zufallsmutagenese mutieren lassen
• gewollten Mutantenphänptyp herausfiltern
• schäumen welches Gen mutiert ist, und daraufhin Zurückschließen welches Protein für die Ausprägung des Wildtyps verantwortlich ist

Question 15

Ziel von Forward Genetics

Answer 15

möglichst alle Gene innerhalb eines Prozesses zu identifizieren

Question 16

Probleme Forwards Genetics

Answer 16

• unterschiedliche Genlänge
• > je länger desto eher mutation
• Mutation kann mehrere Phänotypen verursachen

Question 17

Mutagenese

Answer 17

• gerichtete Mutation
  a) genetische Selektion -> nut gewollte überleben/wachsen
  b) genetisches Screning -> alle Mutanten wachsten, danach alle Individuen auf gewollten Phänotyp überprüfen

Question 18

reverse Genetics

Answer 18

Aufreinigen des Vorgangs den einen interessiert mittels biochemischen Ansatz

• > bestens falls notch 1 Protein übrig
• > aus Aktivität des Proteins kann auf das Gen zurück schließen

Question 19

Methoden reverse Genetics

Answer 19

1. Gen-Knockout
2. Zielgerichtete Mutagenese
3. RNA-Interferenz
   4 chemical Genetics/Genomics

Question 20

Southern Blotting

Answer 20

DNA Dementierung mit einer DNA Sonde

1. Restriktionsverdau DNA
2. Auftragen Gel
3. transfer DNA aus Gel auf Membran
4. Hybridisierung mit markierter Sonde
5. Autoradiogramm -> schwärzen eines Radiofilms an stellen mit Sonde

Question 21

Northern Blotting

Answer 21

Ergänzung zu southern Blotting

- RNA Detektion mit DNA/RNA Sonden (äquivalent zu southern Blotting)

Question 22

Western Blotting

Answer 22

Protein-Detektion mit Antikörper (ähnlich Southern Blotting)

Question 23

Microarray (OMICS Technologie)

Answer 23

• Sonde ist aug unterlage befestigt

Ablauf

1. Gesamt-RNA
2. cDNA
3. Markierung (mit Fluoreszenz Markern)
4. Hybridisierung mit Chip

• > Fluoreszierung bei Hybridisierung -> Signalintesität korreliert mit cDNA menge
• es können mehrer Gene auf einmal getestet werden (veschiedene Marker)

Question 24

Tilling Array (OMICS Technologie)

Answer 24

nucleotidpolymorphismus erkennen

–> man muss gene kennen dafür

Question 25

Next Generation Sequencing (OMICS Technologie)

Answer 25

Kettenabbruchmethode

• > Nukleotide ohne 3OH Ende
• bei Einbau dieser wird Polymerisation abgebrochen
• man erhält unterschiedlich lange Sequenzen
• Austragung auf Gel, man kann mir allen Basen Komplette Sequenzierung vornehmen

Question 26

Illumina Sequenzierung (Next Generation Sequencing)

Answer 26

1. Linker Seq. an DNA Probe binden
2. Probe auf Cluster geben
3. Linker bindet an Cluster linker
4. Polymerase transkribiert
5. Hinzugeben von Markierten Nukletiden (Markieren bei Bindung)

Question 27

ProteOMICS

Answer 27

Methode um viele Proteine in einem Gemisch zum erkennen

Question 28

Massenspektronomie (ProteOMICS)

Answer 28

Identifizierung Peprid anhand Masse
-> kann dann mit Datenbank verglichen werden
Methode : MALDI, B. ESI, LC-MS

Question 29

SILAC (ProteOMICS)

Answer 29

• AS mit schweren Isotopen markieren (behindern nicht die Eigenschaften)
• Vergleich Massendifferenz zwischen markierter und nicht markierter AS -> schauen was danach die Massendifferenz zwischen Proben ist

Question 30

funktionelle Genomik (ProteOMISC)

Answer 30

Bestimmung der Funktion von bestimmten Genen

Question 31

Enhancer Trap (ProteOMISC)

Answer 31

Transposon (mit Gen) springt in die Nähe eines enhancers -> gen weird Exprimiert -> man screen die Probe auf Genprodukt

Question 32

Gal4/ UAS-Sysem (ProteOMICS)

Answer 32

man kann die Expression eines Enhancers/Promoters beobachten