Unidad III: ADN Recombinante Flashcards
¿Que es el ADN recombinante?
Molécula de ADN formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran juntos.
¿Que es la tecnología de ADN recombinante?
Es un conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente.
Protocolo básico de produccion de ADN recombinante
Caracterización del gen de interés:
**secuencia
**proteína que codifica
**propiedades
Clonación del gen de interés
**Amplificación por PCR.
**Inserción a un vector / almacenamiento en genotecas.
Inserción en el organismo blanco (microorganismo, planta, animal… ).
Aplicaciones de la tecnología de ADN recombinante
Producción de medicamentos y vacunas
Mejoramiento genético de plantas y animales (transgénicos).
Producción de metabolitos de interés industrial.
Gen
Secuencia específica de nucleótidos del ADN, que contiene la información necesaria para la síntesis de una proteína o algún tipo de ARN.
Locus
ubicación específica de cada gen en un cromosoma,
(plural: loci).
Genotipo
Composición genética de un organismo
en su totalidad.
**Varía según los alelos que tiene cada
individuo.
fenotipo
Son las características físicas de un individuo.
Alelos:
son formas alternativas de un gen que se hallan en el mismo locus de cromosomas homólogos.
** Se dividen en la meiosis
**El hijo recibe uno de cada progenitor
Tipos de alelos
Alelos homocigotos: alelos idénticos.
Alelos heterocigotos: alelos diferentes.
Alelo dominante: alelo cuyo efecto sobre
un rasgo enmascara el efecto de su par
Alelo recesivo: alelo cuyo efecto es
enmascarado por el dominante.
Cromosomas homólogos:
Cromosomas que forman un par y se pueden recombinar durante la meiosis.
**Mismos loci, alelos diferentes
**Se encuentran en celulas diploides
Tipos de mapas
Mapa genético: indica una región del
cromosoma donde se encuentra un rasgo o característica del organismo (alelo).
Mapa físico: ubican a los genes de una forma específica dentro del cromosoma.
Técnicas de ADN Recombinante
Técnicas para identificar, aislar y unir secuencias de ADN de especies diferentes.
**Ing. Genética: la utiliza para clonar genes de un organismo e introducirlos en otro distinto.
Enzimas de Restricción
Es una proteína cuya función es cortar el ADN en una secuencia específica
**deja extremos cohesivos o romos en la secuencia de ADN
Ligasa de ADN
Enzima (proteína) que une secuencias de ADN complementarios.
Vector de clonación
Es una molécula de ADN que lleva ADN externo a células hospederas (células que reciben el ADN), para generar un organismo transgénico.
Esto ocurre al replicar fragmentos de ADN que llevan insertados.
Características de un vector de clonación
*La molécula es capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
* El vector y el fragmento de ADN se tratan con una endonucleasa (enzima) de restricción, para posteriormente mezclarlos y ligarlos usando una ADN Ligasa.
Elementos esenciales de los vectores de clonación
- Tiene su propio origen de replicación
- Tienen un sitio de clonación múltiple
- Poseen marcadores genéticos coleccionables
Pasos para obtención de plantas transgénicas
- Aislar el gen de interés.
- Clonar el gen en un plásmido.
- Transferirlo a Agrobacterium tumefasciens.
- Transformar tejido vegetal.
- Regenerar plantas completas mediante cultivo de tejidos vegetales.
¿Que es una genoteca?
Colección de clonas, cada una de las cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN/ ARN total de una célula o tejido.
Finalidad de las genotecas
*Aislamiento de secuencias y genes: punto de partida para el estudio molecular.
*Conservación del genoma de estudio (restos arqueológicos, especies en extinción,
individuos con patologías únicas).
*Estudio de la secuencia genómica: conocer la secuencia completa de un genoma implica su clonación previa.
genotecas de ADN genómico
*Colección de clonas que representan (entre todas) el genoma completo de un organismo
*Se digiere el ADN con enzima de restricción.
**Clonación en vector e introducir en bacteria.
Genoteca ADNc
*A partir de ARN, se extrae ARN.
*Representa solo los genes que se expresan en un momento bajo una condición o tratamiento determinado.
*No hay digestión, las moléculas de ARNm ya tienen un tamaño definido.
*Se realiza Transcripción reversa para obtener cDNA.
**Clonación en vector e introducir en bacteria.
Cósmidos
- Vectores híbridos con partes del cromosoma de un fago y de plásmidos.
- Los cósmidos pueden transportar hasta 50 kb de ADN insertado.
Contienen: - Secuencia cos del fago λ, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica.
- Secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos.
Protocolo de los cósmidos
- Digestión del cósmido: Se corta el cósmido con la enzima de restricción correspondiente, lo que lo lineariza.
- Tratamiento con fosforilasa: Se hidrolizan los grupos fosfato de los extremos 5’ para prevenir la agregación del inserto a un extremo.
- Digestión con enzimas de restricción: Tanto el cósmido como la muestra de ADN se tratan con enzimas de restricción compatibles.
- Ligación de ADN: La muestra de ADN se mezcla con el cósmido y se añade ADN ligasa para unirlos.
- Selección de cósmidos apropiados: Se eligen los cósmidos que tienen el tamaño adecuado para ser encapsulados en el fago lambda.
- Infección bacteriana: Los cósmidos seleccionados se infectan en bacterias y se cultivan en medio selectivo con antibióticos.
- Selección de colonias: Las colonias que crecen en el medio selectivo expresan el marcador de selección del vector.
BACs (Cromosomas Artificiales Bacterianos)
- Usado para clonar fragmentos de ADN genómico en Escherichia coli
- Basado en el plásmido factor-F encontrado de modo natural en dicha bacteria.
- De 100 a 300 kb de tamaño; media de
150 kb - Por su tamaño, las estrategias de introducción más eficientes han sido mediante electroporación.
¿Para qué se usan los BACs?
Son muy utilizados como vectores de clonación para la construcción de genotecas debido a su notable capacidad, su gran estabilidad y su bajo porcentaje de quimerismo.
YACs (Cromosomas artificiales de levadura)
- Son los vectores de mayor capacidad (200 – 3,000 kbp).
*Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostack. - Un YAC pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura (eucariota), portando un centrómero y telómeros terminales.
Origen de replicación - Procariotas: relajado, por lo que aparecen muchas copias en cada
bacteria (gran utilidad para producir masivamente el vector) - Levaduras: estricto , apareciendo sólo una copia por célula de levadura.
Protocolo general de clonación en BACs
a) Se corta el vector con HindIII para linealizarlo.
b) Se defosforilan los extremos 5’ del vector para evitar auto-ligación.
c) Se digiere la muestra con HindIII o compatible. Se seleccionan los fragmentos según su tamaño por electroforesis y se purifican.
d) Se lleva a cabo la reacción de ligación.
e) Transferencia de los vectores a una célula por electroporación.
f) Selección de los clones en un medio con cloranfenicol y X-gal (son positivos los que sobreviven en cloranfenicol y carecen de actividad beta-galactosidasa).
Conformación de un BACs típico
OriS (OriV): origen de replicación del plásmido factor F.
repE: control de la replicación del plásmido.
parA, B, C: control de la replicación.
CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de resistencia a cloranfenicol).
LacZ’: con un polilinker (MCS, sitio de clonación múltiple) en su interior. Se usa para el ensayo
de alfa-complementación (reacción con el sustrato X-gal), y selección de bacterias por color.
¿Para qué se usan los YAC’S?
Construcción de genotecas genómicas, siendo muy extendido su uso en los primeros años del Proyecto Genoma Humano.
Son más inestables que otros vectores como BACs, que han acabado imponiéndose.
Composición de un YACs típico
- ARS1: secuencia de replicación autónoma.
- CEN4: centrómero del cromosoma IV, permite la segregación del plásmido durante la división celular.
- TELs: secuencias teloméricas.
- HIS3, TRP1, URA3: Marcadores de selección en levadura.
- SUP4: Marcador de selección.
Protocolo general de clonación en YACs
- Digestión del vector: El vector se digiere con BamHI y EcoRI y se defosforilan los extremos 5’, lo que lo linealiza y activa las secuencias teloméricas. Se eliminan los marcadores His3 y Sup4.
- Digestión de la muestra de ADN: La muestra se digiere con EcoRI, y los fragmentos se seleccionan y purifican.
- Ligación: Los fragmentos de ADN se unen al vector para formar una molécula con un centrómero y telómeros terminales.
- Introducción en células y clonación: La molécula se introduce en células por electroporación y se clona en bacterias. Luego se extraen, purifican y transfieren a levaduras.
- Selección de levaduras portadoras del vector: Las levaduras se cultivan en un medio selectivo y las colonias que crecen y muestran coloración rosada (indicando rotura del SUP4) son seleccionadas.
- Funcionamiento del vector en las levaduras: El vector actúa como un cromosoma adicional en las levaduras.
Escrutinio con hibridación en colonia/placa
- Los clones que contienen el fragmento de interés necesitan ser localizados de la biblioteca y para llegar a este fin, se pueden utilizar técnicas basadas en hibridación.
- El escrutinio o búsqueda del gen en una biblioteca se lleva a cabo, ya sea para estudiar la función de éste o alguna característica.
- Este punto puede ser más difícil que la creación de la misma biblioteca.
- Este es un método frecuentemente utilizado para identificar un fragmento de ADN particular en un plásmido de la biblioteca genómica.
Protocolo general de hibridación en placa / colonia
- Membrana de Nylon sobre la caja Petri que contiene las colonias a analizar.
- Crecimiento de las bacterias sobre la membrana (diifusión de nutrientes de agar a membrana)
- Se lisan bacterias, se desnaturaliza el ADN y se hibrida con la sonda (la sonda se enlazará sólo a fragmentos clonados que contengan al menos una parte de sus genes correspondientes)
- Se lavan las membranas para quitar cualquier sonda no enlazada y el enlace es detectado por autorradiografía de las membranas
- Identificar positivos (pueden ser identificados y aislados para su posterior análisis.)
Escrutinio por PCR
- Esto se realiza normalmente con oligos diseñados para adherirse al vector en vez de unirse al
fragmento de ADN clonado. - El tamaño de los productos amplificados puede ser utilizado para caracterizar el ADN clonado.
- Ventaja : Rapidez de la técnica: 3-4 horas (1 día) aproximadamente,
-
Desventaja: Da una indicación del tamaño de los insertos clonados en lugar de la secuencia del inserto
Pueden usarse oligos específicos para una secuencia particular del ADN clonado dando una caracterización más rigurosa de clones de cDNA y bibliotecas Genómicas.
Plásmidos
Son segmentos de ADN circular extracromosomal que se replican y transcriben independientemente del cromosoma bacteriano.
Características plásmidos
- Contienen marcadores de selección (por ejmplo: resistencia a antibióticos).
- Tienen un origen de replicación.
- Su tamaño oscila normalmente entre 1 y 250 kbp.
- Pueden estar presentes en una, 2 o incluso más copias en una sola célula.
- Permiten clonar fragmentos de hasta 10 kbp.
- Funcionan en diversos organismos.
Clonación de ADN en bacterias
- El ADN con el gel de interés se retira de la célula
- Las enzimas de restricción cortan el gen deseado
- El ADN vector se toma de la bacteria con las miasmas enzimas de restricción
- Se inserta el gen dentro del ADN vector (un plásmido) con una enzima ligasa
- La bacteris se reproduce, dando lugar a un gran número de bacterias con las nuevas caracterósticas
- Las bacterias producen la proteína de interes
Bacteriófagos
Virus que infectan bacterias.
Uno de los más empleados en biología molecular es el
bacteriófago lambda l.
ü Su genoma está completamente secuenciado y cartografiado.
Características bacteriófagos
- Su genoma está completamente secuenciado y cartografiado.
- El tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células.
- Una vez cortados y ligados el ADN vírico y el ADN de interés, los vectores lambda
recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huesped bacterianas. - Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago
infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. - Los vectores del bacteriófago pueden transportar fragmentos de hasta 20 kbp.
Clonación por biobalística
- Se producen muchas copias del gen
- Se tienen partículas cubiertas con la codificación del ADN para el gen deseado
- Se bombardean los pedazos de plantas con las partículas
4- Los cromosomas ahora tienen la codificación del ADN para el gen deseado - Se multiplican las célilas y forman un callo.
- Formación de brote seguido de formación de raíz
- Planta con caracteristica de interés
