Unidad I: Manipulación de ácidos nucleicos Flashcards
Introducción: ¿ Para que extraer ácidos nucleicos?
Establecer relaciones filogenéticas entre individuos/ especies/ seres vivos.
Diagnóstico de enfermedades.
Evaluar los niveles de expresión génica.
Modificar genéticamente organismos.
Introducción: factores que afectan rendimiento, calidad y pureza
- Cantidad del material de partida
- Condiciones en las que se encuentra dicho material.
- Contaminantes en el material biológico
Introducción: protección de la muestra
Contaminación:
1. Material biológico
2. Microbiológica
3. Química
¿Qué es la extracción de ADN?
La extracción consiste en la separación y purificación del ADN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo.
Métodos de extracción de ADN
- Fenol- Cloroformo
+ Orgánica
+ADN buena calidad
- Reactivos tóxicos
-Perdidas significativas de ADN más si está degradado - Salting out
+ Inorgánica
+Reactivos de baja toxicidad
+Permite visualizar la malla de ADN
- Requiere mayor cantidad de muestra
Métodos de extracción de ARN
- Cloruro de Guanidinio
*Desnaturalizante potente para el plegamiento de proteínas —> Random coil
*Tiocianato de Guanidinio —> Lisar células y partículas de virus en extracciones de ADN Y ARN
2.TRIzol
* Reactivó listo para usar diseñado para aislamiento de ARN total de alta calidad o el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas a partir de una variedad de muestras biológicas.
Etapas de purificación de ácidos nucleicos
- Lavar el tejido (dependiendo del origen del material biológico, plantas)
- Triturar o macerar la muestra (N líquido).
- Romper membrana celular (buffer de lisis).
- Degradar proteínas (fenol, cloroformo, guanidinio).
- Eliminar residuos y restos celulares (centrifugación).
- Precipitar el ácido nucleico (etanol abs, isopropanol).
- Lavar el ácido nucleico (etanol 70%).
¿Qué es la electroforesis?
*Método utilizado por primera vez en 1937
*Utiliza una corriente eléctrica controlada
*Para separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica
*A través de una matriz de un polímero.
Fundamentos de la electroforesis
*Las moléculas de ADN (y ARN) poseen un pH alcalino, y una carga negativa.
*La carga eléctrica aplicada a la muestra hace que su movilidad hacia el ánodo esté determinada por el tamaño de su molécula, que debe pasar por los poros del gel que la contiene.
* Para fragmentos pequeños se usan geles de poliacrilamida (10-100 pares de bases). TÓXICA
*Para fragmentos más grandes se usan geles de agarosa. NO TÓXICA
*El gel se prepara en distintas concentraciones en función del tamaño de los fragmentos de DNA (0.8-1%).
Electroforesis
Revelado
*Una vez separadas las moléculas de ADN se visualizan por la fluorescencia de distintos compuestos que se unen a ellas:
1. El más utilizado es el bromuro de etidio
2. SYBR green (invitrogen)
3. GelRed (Biotium).
Electroforesis
Fuentes de error
- Técnica sensible, afectada por errores experimentales.
- La T° de corrida del gel.
- Tiempo de corrida del gel.
- Velocidad de la polimerización.
- Pureza de los reactivos
- Preparación de las muestras.
La electroforesis nos sirve para visualizar el ADN y confirmar:
- No hubo pérdida de ADN.
- Se tiene ADN de buena calidad, que no está degradado.
- Los fragmentos de ADN son del tamaño esperado.
- Se clonó exitosamente un fragmento de ADN en un vector
(plásmido).
¿Que es la restricción de ADN?
Es el proceso mediante el cual se “corta” un fragmento de ADN en
una secuencia de nucleótidos específica por acción enzimática (endonucleasa).
Nucleasas
Enzimas que catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster.
*Endonucleasas
Catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster en secuencias específicas del interior de una cadena de ADN.
*Exonucleasas
Cortan nucleótidos 1 a 1, a partir de los extremos terminales de la cadena de ADN.
Endonucleasa tipo I
Reconocen una secuencia específica de nucleótidos, pero cortan el ADN a una distancia amplia de ese sitio.
**No son muy útiles para biología molecular.