Unidad I: Manipulación de ácidos nucleicos Flashcards
Introducción: ¿ Para que extraer ácidos nucleicos?
Establecer relaciones filogenéticas entre individuos/ especies/ seres vivos.
Diagnóstico de enfermedades.
Evaluar los niveles de expresión génica.
Modificar genéticamente organismos.
Introducción: factores que afectan rendimiento, calidad y pureza
- Cantidad del material de partida
- Condiciones en las que se encuentra dicho material.
- Contaminantes en el material biológico
Introducción: protección de la muestra
Contaminación:
1. Material biológico
2. Microbiológica
3. Química
¿Qué es la extracción de ADN?
La extracción consiste en la separación y purificación del ADN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo.
Métodos de extracción de ADN
- Fenol- Cloroformo
+ Orgánica
+ADN buena calidad
- Reactivos tóxicos
-Perdidas significativas de ADN más si está degradado - Salting out
+ Inorgánica
+Reactivos de baja toxicidad
+Permite visualizar la malla de ADN
- Requiere mayor cantidad de muestra
Métodos de extracción de ARN
- Cloruro de Guanidinio
*Desnaturalizante potente para el plegamiento de proteínas —> Random coil
*Tiocianato de Guanidinio —> Lisar células y partículas de virus en extracciones de ADN Y ARN
2.TRIzol
* Reactivó listo para usar diseñado para aislamiento de ARN total de alta calidad o el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas a partir de una variedad de muestras biológicas.
Etapas de purificación de ácidos nucleicos
- Lavar el tejido (dependiendo del origen del material biológico, plantas)
- Triturar o macerar la muestra (N líquido).
- Romper membrana celular (buffer de lisis).
- Degradar proteínas (fenol, cloroformo, guanidinio).
- Eliminar residuos y restos celulares (centrifugación).
- Precipitar el ácido nucleico (etanol abs, isopropanol).
- Lavar el ácido nucleico (etanol 70%).
¿Qué es la electroforesis?
*Método utilizado por primera vez en 1937
*Utiliza una corriente eléctrica controlada
*Para separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica
*A través de una matriz de un polímero.
Fundamentos de la electroforesis
*Las moléculas de ADN (y ARN) poseen un pH alcalino, y una carga negativa.
*La carga eléctrica aplicada a la muestra hace que su movilidad hacia el ánodo esté determinada por el tamaño de su molécula, que debe pasar por los poros del gel que la contiene.
* Para fragmentos pequeños se usan geles de poliacrilamida (10-100 pares de bases). TÓXICA
*Para fragmentos más grandes se usan geles de agarosa. NO TÓXICA
*El gel se prepara en distintas concentraciones en función del tamaño de los fragmentos de DNA (0.8-1%).
Electroforesis
Revelado
*Una vez separadas las moléculas de ADN se visualizan por la fluorescencia de distintos compuestos que se unen a ellas:
1. El más utilizado es el bromuro de etidio
2. SYBR green (invitrogen)
3. GelRed (Biotium).
Electroforesis
Fuentes de error
- Técnica sensible, afectada por errores experimentales.
- La T° de corrida del gel.
- Tiempo de corrida del gel.
- Velocidad de la polimerización.
- Pureza de los reactivos
- Preparación de las muestras.
La electroforesis nos sirve para visualizar el ADN y confirmar:
- No hubo pérdida de ADN.
- Se tiene ADN de buena calidad, que no está degradado.
- Los fragmentos de ADN son del tamaño esperado.
- Se clonó exitosamente un fragmento de ADN en un vector
(plásmido).
¿Que es la restricción de ADN?
Es el proceso mediante el cual se “corta” un fragmento de ADN en
una secuencia de nucleótidos específica por acción enzimática (endonucleasa).
Nucleasas
Enzimas que catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster.
*Endonucleasas
Catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster en secuencias específicas del interior de una cadena de ADN.
*Exonucleasas
Cortan nucleótidos 1 a 1, a partir de los extremos terminales de la cadena de ADN.
Endonucleasa tipo I
Reconocen una secuencia específica de nucleótidos, pero cortan el ADN a una distancia amplia de ese sitio.
**No son muy útiles para biología molecular.
Endonucleasa tipo II
Reconocen el sitio de restricción, una secuencia palindrómica de 4 a 8 pares de bases, y cortan dentro de ese mismo sitio.
**Se usan en biología molecular.
Endonucleasa tipo III
Reconocen una secuencia específica de nucleótidos, pero cortan a unos cuantos nucleótidos de distancia (25-30).
Enzimas de restricción
Proteínas capaces de reconocer una secuencia específica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN
*Lo cortan en ese punto o cerca de él.
*Sitios de restricción–> 4 y 12 pares de bases
*A menudo palindrómicas.
Tipo de corte: Extremos cohesivos (¬) o Extremos romos (|)
Mapas de restricción
Sirve para analizar donde cortan ciertas enzimas de restricción, cortar una secuencia de ADN y liberar un fragmento de tamaño específico.
Hibridación
Proceso en el que dos moléculas complementarias de cadena sencilla de ADN y/o ARN, de orígenes distintos, se unen y forman una molécula de doble cadena.
*Se necesita que ambas tengan nucleotidos complementarios
Sonda
Cadena sencilla de ADN marcada (radiactiva o fluorescente) con secuencia de nucleótidos conocida. Se utiliza para detectar moléculas de ARN o ADN con secuencia complementaria.
Southern Blot (ADN-ADN)
Técnica para hibridar dos fragmentos de ADN.
Visualización
**Radiografía–> Sondas radiactivas
**Película sensible a la luz–>sondas fluorescentes.
Objetivo del Southern Blot
Comprobar la presencia de un gen o secuencia específica de ADN en el genoma de un organismo.
Northern Blot
Se emplea para identificar cadenas de ARN complementarias o similares a la secuencia de ADN utilizada como sonda.
*Se utiliza frecuentemente en estudios de expresión génica.
*Inicia a partir del ARN
Objetivo del Northern Blot
Confirmar la expresión de un gen en particular bajo condiciones específicas
Método No radiactivo con digoxigenina.
Se utilizan anticuerpos, después un sustrato para visualizar la hibridación en base a la actividad enzimática.
Hibridación in situ: FISH
Fluorescent in situ Hybridization (FISH), se usa para identificar regiones específicas de ADN en los cromosomas.
* Uso de sondas fluorescentes
*Si hay señales fluorescentes, significa que la sonda hibridó en la región blanco.
Western blot: Blotting de proteinas
Técnica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas).
Con esta técnica se comprueba que el ARNm se tradujo en proteína y que es funcional.
SDS
*se emplea comúnmente en la preparación de proteínas para electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE.
*actúa desnaturalizando las proteínas provocando que pierdan su conformación nativa.
*se une a las zonas apolares del péptido.
Etapas de las hibridaciones
- Extracción de ADN/ARN/proteína.
- Separación por peso, tamaño, carga en gel de electroforesis.
- Transferencia a memebrana.
- Fijación/Bloqueo de la membrana.
- Hibridación con sonda/anticuerpo.
- Detección: radioactividad, reacción enzimática, luminiscencia.
- Revelado.
