Unidad I: Manipulación de ácidos nucleicos Flashcards

1
Q

Introducción: ¿ Para que extraer ácidos nucleicos?

A

 Establecer relaciones filogenéticas entre individuos/ especies/ seres vivos.
 Diagnóstico de enfermedades.
 Evaluar los niveles de expresión génica.
 Modificar genéticamente organismos.

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2
Q

Introducción: factores que afectan rendimiento, calidad y pureza

A
  1. Cantidad del material de partida
  2. Condiciones en las que se encuentra dicho material.
  3. Contaminantes en el material biológico
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3
Q

Introducción: protección de la muestra

A

Contaminación:
1. Material biológico
2. Microbiológica
3. Química

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4
Q

¿Qué es la extracción de ADN?

A

La extracción consiste en la separación y purificación del ADN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo.

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5
Q

Métodos de extracción de ADN

A
  1. Fenol- Cloroformo
    + Orgánica
    +ADN buena calidad
    - Reactivos tóxicos
    -Perdidas significativas de ADN más si está degradado
  2. Salting out
    + Inorgánica
    +Reactivos de baja toxicidad
    +Permite visualizar la malla de ADN
    - Requiere mayor cantidad de muestra
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6
Q

Métodos de extracción de ARN

A
  1. Cloruro de Guanidinio
    *Desnaturalizante potente para el plegamiento de proteínas —> Random coil
    *Tiocianato de Guanidinio —> Lisar células y partículas de virus en extracciones de ADN Y ARN
    2.TRIzol
    * Reactivó listo para usar diseñado para aislamiento de ARN total de alta calidad o el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas a partir de una variedad de muestras biológicas.
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7
Q

Etapas de purificación de ácidos nucleicos

A
  • Lavar el tejido (dependiendo del origen del material biológico, plantas)
  • Triturar o macerar la muestra (N líquido).
  • Romper membrana celular (buffer de lisis).
  • Degradar proteínas (fenol, cloroformo, guanidinio).
  • Eliminar residuos y restos celulares (centrifugación).
  • Precipitar el ácido nucleico (etanol abs, isopropanol).
  • Lavar el ácido nucleico (etanol 70%).
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8
Q

¿Qué es la electroforesis?

A

*Método utilizado por primera vez en 1937
*Utiliza una corriente eléctrica controlada
*Para separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica
*A través de una matriz de un polímero.

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9
Q

Fundamentos de la electroforesis

A

*Las moléculas de ADN (y ARN) poseen un pH alcalino, y una carga negativa.
*La carga eléctrica aplicada a la muestra hace que su movilidad hacia el ánodo esté determinada por el tamaño de su molécula, que debe pasar por los poros del gel que la contiene.
* Para fragmentos pequeños se usan geles de poliacrilamida (10-100 pares de bases). TÓXICA
*Para fragmentos más grandes se usan geles de agarosa. NO TÓXICA
*El gel se prepara en distintas concentraciones en función del tamaño de los fragmentos de DNA (0.8-1%).

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10
Q

Electroforesis

Revelado

A

*Una vez separadas las moléculas de ADN se visualizan por la fluorescencia de distintos compuestos que se unen a ellas:
1. El más utilizado es el bromuro de etidio
2. SYBR green (invitrogen)
3. GelRed (Biotium).

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11
Q

Electroforesis

Fuentes de error

A
  1. Técnica sensible, afectada por errores experimentales.
  2. La T° de corrida del gel.
  3. Tiempo de corrida del gel.
  4. Velocidad de la polimerización.
  5. Pureza de los reactivos
  6. Preparación de las muestras.
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12
Q

La electroforesis nos sirve para visualizar el ADN y confirmar:

A
  • No hubo pérdida de ADN.
  • Se tiene ADN de buena calidad, que no está degradado.
  • Los fragmentos de ADN son del tamaño esperado.
  • Se clonó exitosamente un fragmento de ADN en un vector
    (plásmido).
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13
Q

¿Que es la restricción de ADN?

A

Es el proceso mediante el cual se “corta” un fragmento de ADN en
una secuencia de nucleótidos específica por acción enzimática (endonucleasa).

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14
Q

Nucleasas

A

Enzimas que catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster.
*Endonucleasas
Catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster en secuencias específicas del interior de una cadena de ADN.
*Exonucleasas
Cortan nucleótidos 1 a 1, a partir de los extremos terminales de la cadena de ADN.

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15
Q

Endonucleasa tipo I

A

Reconocen una secuencia específica de nucleótidos, pero cortan el ADN a una distancia amplia de ese sitio.
**No son muy útiles para biología molecular.

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16
Q

Endonucleasa tipo II

A

Reconocen el sitio de restricción, una secuencia palindrómica de 4 a 8 pares de bases, y cortan dentro de ese mismo sitio.
**Se usan en biología molecular.

17
Q

Endonucleasa tipo III

A

Reconocen una secuencia específica de nucleótidos, pero cortan a unos cuantos nucleótidos de distancia (25-30).

18
Q

Enzimas de restricción

A

Proteínas capaces de reconocer una secuencia específica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN
*Lo cortan en ese punto o cerca de él.
*Sitios de restricción–> 4 y 12 pares de bases
*A menudo palindrómicas.
Tipo de corte: Extremos cohesivos (¬) o Extremos romos (|)

19
Q

Mapas de restricción

A

Sirve para analizar donde cortan ciertas enzimas de restricción, cortar una secuencia de ADN y liberar un fragmento de tamaño específico.

20
Q

Hibridación

A

Proceso en el que dos moléculas complementarias de cadena sencilla de ADN y/o ARN, de orígenes distintos, se unen y forman una molécula de doble cadena.
*Se necesita que ambas tengan nucleotidos complementarios

21
Q

Sonda

A

Cadena sencilla de ADN marcada (radiactiva o fluorescente) con secuencia de nucleótidos conocida. Se utiliza para detectar moléculas de ARN o ADN con secuencia complementaria.

22
Q

Southern Blot (ADN-ADN)

A

Técnica para hibridar dos fragmentos de ADN.
Visualización
**Radiografía–> Sondas radiactivas
**Película sensible a la luz–>sondas fluorescentes.

23
Q

Objetivo del Southern Blot

A

Comprobar la presencia de un gen o secuencia específica de ADN en el genoma de un organismo.

24
Q

Northern Blot

A

Se emplea para identificar cadenas de ARN complementarias o similares a la secuencia de ADN utilizada como sonda.
*Se utiliza frecuentemente en estudios de expresión génica.
*Inicia a partir del ARN

25
Q

Objetivo del Northern Blot

A

Confirmar la expresión de un gen en particular bajo condiciones específicas

26
Q

Método No radiactivo con digoxigenina.

A

Se utilizan anticuerpos, después un sustrato para visualizar la hibridación en base a la actividad enzimática.

27
Q

Hibridación in situ: FISH

A

Fluorescent in situ Hybridization (FISH), se usa para identificar regiones específicas de ADN en los cromosomas.
* Uso de sondas fluorescentes
*Si hay señales fluorescentes, significa que la sonda hibridó en la región blanco.

28
Q

Western blot: Blotting de proteinas

A

Técnica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas).
Con esta técnica se comprueba que el ARNm se tradujo en proteína y que es funcional.

29
Q

SDS

A

*se emplea comúnmente en la preparación de proteínas para electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE.
*actúa desnaturalizando las proteínas provocando que pierdan su conformación nativa.
*se une a las zonas apolares del péptido.

30
Q

Etapas de las hibridaciones

A
  1. Extracción de ADN/ARN/proteína.
  2. Separación por peso, tamaño, carga en gel de electroforesis.
  3. Transferencia a memebrana.
  4. Fijación/Bloqueo de la membrana.
  5. Hibridación con sonda/anticuerpo.
  6. Detección: radioactividad, reacción enzimática, luminiscencia.
  7. Revelado.