Unidad II: Secuenciación Y Amolificación De ADN

Question 1

¿Qué es la secuenciación del ADN?

Answer 1

Conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de todos los nucleótidos (A, C, G y T) que componen un fragmento de ADN.

Question 2

Secuenciación de Sanger

Answer 2

Secuenciación por terminador de cadena o Método dideoxi
*Más eficiente, menos peligroso y más barato que el método de Maxam-Gilbert
*Se usan dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de cadena
*Los fragmentos sintetizados se corren en un gel de poliacrilamida y se visualizan las bandas por autorradiografía o luz UV.

Question 3

¿Qué debe contener la reacción de secuenciación de Sanger?

Answer 3

*ADN muestra
*Un oligonucleótido
*ADN polimerasa
*dNTPs
*Un ddNTPs (marcado radiactiva o fluorescentemente)

Question 4

¿Cuándo se detiene la polimerización?

Answer 4

cuando la ribosa pierde un oxígeno ya que se le es imposible formar un enlace fosfodiéster con otro nucleótido
*Por lo tanto, queda un fragmento de ADN, con el ddNTP
correspondiente como último nulceótido.

Question 5

Pirosecuenciación

Answer 5

Método de secuenciación de adn basado en la liberacion de los pirofosfatos que tiene lugar en la reacción de polimerización del ADN a partir de sus dNTPs
* Se requiere ADN de cadena sencilla (ssADN)

Question 6

¿Qué se requiere para iniciar el proceso de pirosecuanciación?

Answer 6

el ssADN hibridado se dberá incuba con las enzimas ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa, y los sustratos APS y luciferina

Question 7

proceso de la pirosecuenciación

Answer 7

1.- Se incorporan 4 dNTPs a la cadena gracias a la polimerasa–> se libera 1pirofosfato/1 base
2.- la ATP sulfurilasa convierte el PPi a ATP (en presencia de APS).
3.-Los nucleótidos que no se incorporaron y el ATP restante son degradados por la apirasa

Question 8

aplicaciones de la secuencia de ADN

Answer 8

*obtener información de la secuencia de un fragmento de ADN
*detección de mutaciones
*diagnostico de enfermedades
*relaciones en la evolución
*identificación de genes
*identificación de especies

Question 9

SOLiD

Answer 9

*Técnica de nueva generación que se basa en PCR, y tiene la capacidad de generar cientos-miles de millones de lecturas a la vez
* Ha permitido bajar los costos e incrementar la capacidad de secuenciación de los aparatos

Question 10

Plataformas para pirosecuenciación

Answer 10

*Pirosecuenciación
*454 pirosecuenciación
*Oxford nanopore technologies
*Ilumina
*Torrent
*SOLiD
*Life technologies
*applied byosistems

Question 11

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Answer 11

Técnica empleada para generar una gran cantidad de copias de una secuencia específica de ADN in vitro, a partir de una pequeña cantidad de muestra de ADN.
-La replicación del ADN es un proceso semiconservativo
-Las nuevas cadenas se sintetizan siempre de 5’ a 3’
- ADN Polimerasa: Enzima multimérica encargada de sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de una hebra molde de cadena sencilla (templado).
- La desnaturalización del ADN por temperatura es un proceso reversible.

Question 12

Requerimientos esenciales

Answer 12

• ADN de doble cadena que actúe como molde: muestra.
• 2 oligonucleótidos sintéticos (Forward y Reverse, Directo y Reverso), complementarios a regiones en cadenas opuestas de ADN (también llamados oligos, primers, iniciadores, cebadores), son cadenas sencillas de ADN de aprox. 20-30 nucleótidos.
• Una ADN polimerasa termoestable, temperaturas de 96 °C.
• Los 4 dNTPs.
• Buffer con Magnesio, como cofactor para la ADN polimerasa.
• Termociclador.

Question 13

Polimerasas usadas

Answer 13

1. Taq polimerasa (Thermus aquaticus). –> Alta Procesividad
2. Pfu polimerasa (Pyrococcus furiosus). –>Alta Fidelidad
3. Vent polimerasa (Thermococcus litoralis). –> Alta Fidelidad
4. Tth polimerasa (Thermus termophilus). –> No distingue entre ADN Y ARN

Question 14

Procesividad (prueba de PCR)

Answer 14

Capacidad de las ADN polimerasas de agregar cierta cantidad de nucleótidos cada vez que se une a la cadena molde.

Question 15

Fidelidad

Answer 15

Capacidad de las ADN polimerasas de agregar el nucleótido correcto en el orden indicado al sintetizar una cadena de ADN. La actividad de exonucleasa 3’-5’ de las polimerasas HF les da la capacidad de corregir errores en la replicación.

Question 16

Ciclos de amplificación
PCR reacciones

Answer 16

1. Desnaturalización
   -1 min. a 95°C
2. Alineamiento
   -Unión de los oligonucleótidos con las cadenas de la muestra de ADN (molde/templado).
   -De 0.5 - 1 min. a 40-68 °C,
3. Extensión
   -La ADN polimerasa se une al híbrido ADN molde-oligo para
   sintetizar la cadena complementaria.
   -A 72 °C y durante 1 min. x cada
   1000 pares de bases (pb) del producto de amplificación esperado.

Question 17

Etapas de PCR

Answer 17

Desnaturalización inicial:
-La mezcla de reacción a T= 95 °C por 3-5 minutos
-Separa la estructura de doble hélice del ADN problema.
Ciclos de Amplificación:
-Constan de 3 etapas básicas consecutivas de corta duración
que se repiten entre 20-35 veces
Extensión final:
-Al final de los 20-35 ciclos
-Asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea amplificado.
-De 5 y 10 min. y se realiza a 72 °C.
Conservación:
-T= 4-15 °C por un tiempo indefinido en el corto plazo.

Question 18

Diseño de oligonucleótidos

Answer 18

*Se recomienda usar oligos de más de 15 bp (lo ideal es de 18-25 bp).
* - longitud = - especificidad
* + longitud = - eficiencia
*La longitud del par de oligos no debe diferir en más de 3 bases entre los dos.
*Evitar poli A/G/C/T.
*La Tm melting temperature –temperatura de alineamiento de los oligos no debe diferir en más de 5 °C entre los dos.
*Los oligos no deben tener regiones complementarias entre sí.
*Sofware o link adecuado para diseñar la secuencia específica de los oligos (“Primer design tool – Primer-BLAST” )
* Para calcular un aproximado de la Tm de los oligos se puede usar la siguiente fórmula empírica: Tm (°C) = 4 (G’s y C’s) + 2 (A’s y T’s)

Question 19

Visualización de fragmentos amplificados por PCR

Answer 19

1. Aislar el ADN muestra.
2. Realizar PCR.
3. Correr gel de agarosa.
4. Visualizar los fragmentos amplificados que correspondan al tamaño esperado (fotodocumentador).
5. Guardar imagen.

Question 20

¿Por qué se realizan modificaciones a la PCR?

Answer 20

La PCR presenta limitaciones, por lo que actualmente existen otras técnicas que cambian algunos aspectos de la PCR estándar para mejorar su efectividad, aumentar la sensibilidad y extender su campo de aplicación.

Question 21

PCR anidada o nested

Answer 21

implica la realización de dos reacciones PCR consecutivas, donde la segunda utiliza los productos de amplificación de la primera como ADN molde con ayuda de oligos que se encuentran dentro de la primera secuencia amplificada (deseada).

Question 22

¿Por qué usar la PCR nested?

Answer 22

• Elimina o disminuye la contaminación por productos inespecíficos, debido a la alineación no específica de los oligos empleados.
• Mejora la especificidad
• Alta sensibilidad
• Requiere cantidades muy pequeñas de material genético.

Question 23

Proceso de la PCR anidada

Answer 23

1.- En la primera ronda, se realiza una reacción con los iniciadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el segmento diana.
2.- Luego, con este producto de amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos, específicos para la región de interés.

Question 24

PCR múltiple

Answer 24

Combina dos o más pares de oligos en un mismo tubo, junto con el resto de
los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar
simultáneamente varios segmentos de ADN.

Question 25

¿Por qué usar la PCR múltiple?

Answer 25

• Proporciona información sobre varios genes o loci en una sola reacción
• Menor cantidad de ADN para el análisis
• Optimiza cantidad de reactivos.

Question 26

Cuidados de la PCR múltiple

Answer 26

• Todos los oligos empleados deben tener una Tm similar y carecer de regiones complementarias entre sí.
• Deben obtenerse fragmentos de ADN de diferentes tamaños para que se
  puedan diferenciar.

Question 27

SIstema de PCR múltiple

Answer 27

1.- Elegir un locus
2.- Posicionar los cebadores en las regiones con secuencias detalladas en relación con los tamaños de los amplicones
3.- Diseñar cebadores con cinética de reacciones similares
4.- Desarrollar las condiciones para PCR de manera separada para cada set de cebadores.
5.- Añadir Secuencialmente los sets de Cebadores, alterando las condiciones como sea necesario.
6.- Ajustar los componentes de la reacción y las condiciones del termociclador para la amplificación múltiple.
7.- Realizar el PCR

Question 28

RT-PCR (transcripción reversa)

Answer 28

Emplea ARN como molde inicial en vez de ADN, así como una transcriptasa inversa para realizar la síntesis de un ADN complementario (ADNc, cDNA) al ARN.

La mezcla de reacción se calienta a 37 ̊C, lo que permite la producción de copias de ADNc complementario a partir de la muestra de ARN mediante la transcriptasa inversa.

Question 29

Ventajas de la RT-PCR

Answer 29

• Elimina la necesidad del proceso de purificación del ARNm requerido en las técnicas de clonado convencionales.
• Permite verificar el nivel de expresión de un gen (similar a Northern).
• Al generarse el ADNc a partir de ARNm, se obtienen secuencias libres de
  intrones.
• Podemos clonar el producto de amplificación de un gen de eucariotas
  para su expresión en procariotas.

Question 30

Proceso de la RT-PCR (transcripción reversa)

Answer 30

El desarrollo inicial de una RT-PCR sería:
1. Retrotranscripción a partir del ARN (para obtener la cadena de ADNc).
2. Amplificación a partir de la primera cadena sencilla de ADNc.
3. PCR estándar.

Question 31

PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR).

Answer 31

Variante de PCR utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar el producto de
la amplificación de un fragmento de ADN. Permite cuantificar en cada ciclo de amplificación la intensidad de señal (fluorescencia).

A la mezcla de reacción se le agrega un fluoróforo (SYBR green u otro), que al unirse
con ADN y ser “excitado” a una l específica emitirá una señal luminosa cuantificada por
un termociclador especial.

Question 32

Proceso de monitoreo de la qPCR.

Answer 32

1.- Se monitorea cada ciclo utilizando un indicador fluorescente.
2.- El aumento de la fluorescencia se representa frente al número de ciclo para generar la curva de amplificación
3.- Con la curva se puede determinar un valor de Cq del ciclo de cuantificación (a menudo descrito como Ct para el umbral del ciclo).

Cq: corresponde al número de ciclos para los cuales la cantidad de fluorescencia es significativamente mayor que la fluorescencia de fondo.

Question 33

Aplicaciones de la PCR

Answer 33

• Detectar secuencias de ADN de interés en una muestra (similar a Southern).
• Clonar secuencias de ADN en vectores.
• Identificación molecular de especies.
• Determinación de carga viral
• Diagnóstico de enfermedades hereditarias.
• Análisis filogenéticos.
• Verificar el nivel de expresión de un gen (similar a Northern).
• Medicina forense.
• Detección de fitopatógenos y de OGM’s.