Understanding methods Flashcards
What is the composition of a regular AAV
Single-stranded DNA genome packaged within a protein capsid.
What is the general aim behind using an AAV ?
Vector for delivering genetic material into host cells.
How AAV are modified to target specific types of cells?
By modifying the viral capsid proteins. These modified capsids determine the viral tropism, which is the virus’s ability to infect particular cell types.
What does the episomal form of AAV refers to ?
the genetic material forming a circular or linear molecule that can replicate autonomously in the cell’s cytoplasm or nucleus without integrating into the host cell’s chromosomal DNA.
Cite d’autres méthode de transfert de gêne.
-TRANSFECTION
-TRANSDUCTION VIRALE (retrovirus, lentivirus)
-NANOCARRIER
-CRISPRCAS9
Citer 4 méthode de transfection de gène.
TRANSFECTION CHIMIQUE (Matériel génétique combinés avec des lipides cationiques)
ELECTROPORATION
LIPOFECTION (acides nucléiques sont encapsulés dans des liposomes
MICRO INJECTION
En quoi consiste un retrovirus/lentivirus pour le transfert de gêne ?
-Virus se fixe a un recepteur specifique de la cellule et y libère son matériel génétique
-transcriptase inverse (enzyme) fait de une transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire.
-intégration de ADNc au génome grace à une intégrase (enzyme).
Différence entre lenti et rétrovirus ??
1-Les rétrovirus ont un cycle de réplication plus court, ce qui signifie qu’ils peuvent produire des particules virales plus rapidement après l’infection initiale, Les lentivirus sont connus pour leur capacité à établir une infection latente à long terme
2-Les rétrovirus peuvent avoir un spectre d’hôtes plus large et infecter diverses espèces
En quoi consiste l’électroporation pour le transfert de gêne ?
Des impulsions électriques provoqant une réversibilité temporaire de la membrane cellulaire.
En quoi consiste les nanocarriers pour le transfert de gêne ?
Transportent des acides nucléiques (gènes) dans les cellules, les protéger de la dégradation, et faciliter leur libération ciblée à l’intérieur des cellules
Les nanocarriers sont de minuscules structures, composés de matériaux biocompatibles et biodégradables tels que des lipides, des polymères, des nanoparticules métalliques, ou des matériaux hybrides.
Une fois à l’intérieur des cellules, les nanocarriers libèrent l’acide nucléique qu’ils transportent. Cela peut se produire par des mécanismes tels que la dégradation enzymatique des nanocarriers, la fusion avec des membranes cellulaires, ou la désassemblage des nanoparticules, selon le type de nanocarrier.
En quoi consiste Crispr Cas9 pour le transfert de gêne ? et quelle est la différence avec la cre recombinase ?
CRISPR-Cas9 = protéine Cas9 et d’un ARN guide (ARNg) pour cibler et couper des séquences d’ADN spécifiques dans le génome. permet généralement des modifications plus précises du génome que Cre.
A quoi est lié le matériel génétique pour la transfection chimique de gène ?
lipides cationiques ou des polymères
Longueur d’absorbsion et d’émission pour mCherry ?
Absorbtion: 540-590nm
Emission:550/650nm
Longueur d’absorbsion et d’émission pour eYFP ?
Absorbtion: 513
Emission: 527
Principe de la fluorométrie ?
On envoie une source lumineuse, on sélectionne le filtre d’excitation qui laissera passer une certain longueur d’onde. La lumière qui est renvoyée passe par un filtre d’émission qui bloque les longueur d’onde qu’on ne veut pas recevoir.
Avantage de l’utilisation de cre recombinase ?
Avantages :
Contrôle Spatiotemporel Précis : Cre recombinase permet un contrôle précis de l’activation ou de la désactivation de gènes spécifiques dans certaines cellules ou à des moments précis du développement, ce qui est particulièrement utile pour des études de perte de fonction.
Flexibilité : Le système Cre/loxP est compatible avec divers modèles animaux et peut être utilisé pour des applications spécifiques à un organe ou à un tissu.
Réversibilité : Si nécessaire, le processus de recombinaison peut être inversé, ce qui permet de restaurer l’expression du gène d’intérêt.
Désavantage de l’utilisation de cre recombinase ?
Désavantages :
Complexité Technique : L’utilisation de Cre recombinase nécessite la génération préalable de souris transgéniques exprimant Cre sous le contrôle d’un promoteur spécifique. Cela peut être un processus complexe et coûteux.
Potentiel d’Effets Secondaires : L’expression inappropriée de Cre recombinase ou des effets hors cible peuvent avoir des conséquences indésirables sur le modèle animal ou l’expérience.
Limitations pour les Études à Court Terme : Si l’objectif est une expression de gène à court terme, l’utilisation de Cre recombinase peut être excessive en termes de complexité et de ressources.
Désavantage de l’utilisation d’AAV ?
Expression Transitoire : L’expression des gènes introduits par adénovirus est généralement temporaire et diminue au fil du temps. Pour des études à long terme, cela peut nécessiter des infections répétées.
Réponse Immunitaire : L’infection par les adénovirus peut déclencher une réponse immunitaire dans l’organisme hôte, ce qui peut limiter la persistance de l’expression du gène d’intérêt.
Taille Limitée du Gène : La taille du gène que l’on peut insérer dans un adénovirus est limitée, ce qui peut exclure certains gènes volumineux.
size of eYFP ?
720 base pairs
size of mCherry ?
678 base pairs in length
Explain the action mechanism of PFA .
When paraformaldehyde is dissolved in water, it forms formaldehyde (CH2O), which can penetrate cells and tissues. Formaldehyde is highly reactive and can react with amino groups (NH2) of proteins. This reaction results in the formation of covalent bonds (cross-links) between adjacent protein molecules, effectively “fixing” or immobilizing them in their current state.
Why have we used PBS ?
PBS acts as a buffer, helping to maintain a stable pH level in experimental solutions. This is crucial for many biological and biochemical reactions that are pH-sensitive. The buffering capacity of PBS helps prevent significant changes in pH due to the addition of acidic or basic substances. Phosphate-buffered saline (PBS).
PBS is preferred in many applications because it closely mimics the ionic composition and pH of physiological fluids
Site alternatives to PBS
Ringer’s Solution, HEPES-Buffered Saline (HBS) for cell culture, Tris-Buffered Saline (TBS).
Site alternatives to PFA.
Acetone, formaldehyde, zync formalin, Glutaraldehyde (electron microscopy).
Explain basic principle of cre recombinase.
Cre c’est une enzyme qui se fixe a des loxP site. Si les deux sont dans la même orientation elle coupe la séquence qui se trouve entre les deux sites. En revanche sils sont dans une orientaiton inverses elle retourne la séquence d’adn qui se trouve entre les deux site.
Quel est l’avantage de l’utilisation d’un DIO plutôt que d’un simple floxed ?
DIO viral vectors provide a more sophisticated level of control over gene expression. The ability to conditionally and reversibly regulate gene expression in a spatially and temporally precise manner
What is the principle of channel rhodopsin ?
It is a light sensitive protein. When exposed to a specific wavelength, it undergoes a conformationnal change, allowing it to conduct ions.
What is the aim of using ChETA subtype ?
ChETA allows for more precise control over the timing of neuronal activation.
What about ChR2 ?
allowing the influx of positively charged ions, such as sodium ions (Na+), into the neuron.
Cite les avantages de l’utilisation de channel rhodopsin.
1-Contrôle précis de l’activité neuronale
2-Non-invasif
3-Réversibilité
4-Sélectivité génétique
5-Recherche fondamentale et translationnelle
Cite les inconvénients de l’utilisation de channel rhodopsin.
1-Limitation à la lumière
2-Potentiel de stress cellulaire
3-Complexité expérimentale
4-Coûts élevés
5-Potentiel de réponses non naturelles
Si je n’avais pas voulu utiliser la fluorescence pour observer le CLT, quelle autre méthode aurais-je pu utiliser ?
Tract Tracing with Dye (Horseradish peroxidase, Biotinylated dextran, amine)
Immunohistochemistry
MRI Imaging
Electron Microscopy for microstructure
how could you vizualise myelin sheats ?
Myelin Staining using Luxol Fast Blue or Black Gold II
Site common marker used in immunohistochemistry to visualize CST neurons.
CTIP2
SATB2
Layer V markers as CUX1 and RORbeta.
Advantages of using fluorescence microscopy
1-High Sensitivity and Specificity
2-Multicolor Imaging:
3-Live Cell Imaging
4-Subcellular Resolution
5-Quantitative Analysis:
6-Molecular Biology Applications
7-Low Phototoxicity:
8-Versatility
9-Fluorescent Proteins
10-Visualization of Difficult Targets
Disdvantages of using fluorescence microscopy
1-Photobleaching
2-Phototoxicity( induce cellular damage, alter biological processes, or affect the accuracy of the observations)
3-Background Autofluorescence
4-Limited Depth of Penetration
5-Resolution Limit
6-Bleed-Through and Crosstalk
7-Fluorophore Toxicity
8-Sample Preparation Challenges
9-Limited Quantitative Information : may not provide absolute quantification of molecular concentrations or other parameters without additional calibration.
10-Cost and Equipment Requirements
11-Complexity of Data Analysis
12Limited Field of View
Define why the quantitative information are limited using fluorescence
Fluorophore emission intensity may NOT ALWAYS EXHIBIT A LINEAR RESPONSE TO CONCENTRATION. At high concentrations, quenching or self-absorption effects can reduce fluorescence intensity, leading to nonlinearity in the relationship between fluorophore concentration and signal intensity.
