Transkription Flashcards
Beschreibe die RNA Polymerase der Prokaryonten.
-DNA-abhängig
-5 U.E (2x Alpha, 1 x Beta und 1 x Beta ˋ und 1x Omega) mit vorläufigem Sigma
- erstellt mRNA, tRNA und rRNA
-während allen Schritten der Transkription vorliegend
-Funktion: Scannen, Interaktion mit Aktivatoren/Repressoren, Entwinden & Lesen der ssDNA, NTP-Selektion, Identifizierung des Terminatorsignals
- Nukleotidverknüpfung ist Mg^2+ (2x) und Asp (2x) abhängig
Beschreibe den Ablauf der Initiation (Prokaryonten).
- RNAP Holoenzym fährt über entwundende dsDNA um Promotor zu finden
-Promotorerkennung durch den vorläufigen Sigma70-Faktor der RNAP, anschliessender Transkriptionsstart durch Reduktion unspezifischer Bindung
-nach Promotorerkennung bindet RNAP an DNA und bildet geschlossenen Komplex -> Transkriptionsblase formt sich
Wofür wird die Topoisomerase benötigt ?
Zum Absuchen der DNA von der RNAP. muss DNA entwunden werden.
-ohne Topoisomerase würde Supercoiling entstehen ( positive überdrehen vor der Transkriptionsstelle und negative dahinter)
Wie wird der Promotor gebunden ?
Die UP-Elemente, also den Upstream Promotor wird von der Alpha U.E der RNAP gebunden
Beschreibe den Promotor von Prokaryoten.
-Der Promotor beschreibt den Abschnitt von -10 bis -35 Basen vorm Transkriptionsstart.
- darin enthalten z.B Pribnowbox (wie Agata-Box)
Beschreibe die Elongation der Prokaryonten.
-nach Formation der Transkriptionsblase kommen Elongationsfaktoren dazu
-Elongation beginnt nach Formation der ersten Phosphorylierung-dieesterbindung
-NusA bindet an elongierende RNAP und schwächt & ersetzt Sigma-Faktor-Bindung
-während Elongation circa 100 NTPs pro Sekunde zum entstehenden RNA-Molekühle hinzugefügt
Beschreibe die Termination. Wo drin wird unterschieden ?
-spezifische Terminatorsequenz signalisiert Termination von RNA-Synthese
- RNA-DNA Hybrid dissoziiert und DNA zurück in Helix
Besonderheit: 2 verschiedene Varianten Rho- abhängig und Rho-unabhängig
Worin unterscheiden sich die Rho-abhängige und Rho-unabhängige Termination ?
Rho-unabhängig:
-Produktion von Selbst-Komplementären Terminatorsequenz
-> hoch-konservierte AAA-Sequenz im Vorlagestrang wird zu UUU transkribiert wodurch sich RNA-Haarnadel formt. RNA/DNA-Hybrid durch Haarnadel gestört, wodurch RNAP dissoziiert
Rho-abhängig: (Rho=Helikaseprotein)
-CA-reiche Terminatorsequenz = Rho-Nutzungssequenz. Rho assoziiert mit RNA und migriert in 5ˋ->3ˋ Direktion bis es Transkriptionsstelle erreicht
-ATP-abhängig
Welche Antibiotika interferieren mit der Transkription ?
-Rifampicin: blockiert Transkriptionsinitiationsprozess durch Verhinderung der ersten Phosphodiesterbindung in RNA-Transkript
-Actinomycin D bindet dsDNA (ist ein Polypeptid)
Was ist ein Operon und wofür ist es da ? Unterschied zwischen Prokaryoten und Eukaryonten?
Operons arrangierenden regulieren Gene
-in Prokaryoten werden polycistronische mRNA produziert und in Eukaryonten Monocistronische
-> regulatorische Gene kodieren Repressoren, die an Operator binden
Beispiele: Lac-Operon, LUX-Operon, Pur-Repressor, Trip.-Repressor, Lambda und Cro-Represor
(Wenn hohe Konzentration vorhanden wird Operator gebunden und Transkription pausiert)
Welche beiden DNA-Bindungsdomainen von regulatorischen Proteinen gibt es ?
Helix-Turn-Helix und Zinkfinger
Wie wird die Expression in Prokaryoten aktiviert?
Welche Rolle spielt CRP dabei ?
Durch aktivatoren; z.B bei hoher cAMP-Konzentration werden viele katabolische Enzyme durch CRP (cAMP-Rezeptorprotein) stimuliert
Welche verschiedenen RNA-Polymerasen gibt es und welche RNAs entstehen dadurch ?
Typ 1: transkribiert rRNA
Typ 2: transkribiert mRNA, kleine nukleare RNA (snRNA) und mikroRNA (miRNA)
Typ 3: transkribiert tRNA und 5S rRNA
Wie viele Untereinheiten hat der Typ 2 RNA-Polymerase ?
12
Wie lauten die Schritte der Eukaryotischen Transkription?
Assembly, Initiation, Elongation, Termination
Welche Transkriptionsfaktoren gibt es bei den Eukaryonten und welche Funktion erfüllen sie ?
-TBP: erkennt TATA-Box
-TFIIA: stabilisiert TBP und TBIIB-Bindung an den Promotor
-TFIIB: rekrutiert Pol II-THIIF-Komplex und Bindung an den Promotor
-TFIID: wird benötigt für Initiation an Promotor ohne TATA-BOX
-TFIIE: rekrutiert TFIIH und besitzt sowohl ATPase- und Helikaseaktivität
-TFIIF: beugt Bindung von nicht-spezifischer DNA-Sequenz vor
-TFIIH: entwindet DNA (Helikaseaktivität), phosphoryliert RNAPII CTD (Ser7) und rekrutiert Nukleotid-Exicisionsreperaturprotein
=> alle zusammen bilden den geschlossenen Preinitiationskomplex
Beschreibe das Assembly der Transkription (Reihenfolge der Bindung der TFs):
-TBP bindet an Promotor; wird von TFIID und TFIIB stabilisiert
-TFII ? Und RNAPII werden vom Mediatorkomplex begleitet rekrutiert
- TFIIE und TFIIH werden rekrutiert und ein geschlossener Komplex bildet sich
=> Pre-Initiationskomplex
Beschreibe die 3 Schritte der Elongation
1) Promotorbeseitigung & Bildung des EEC = early Elongation complex -> frühe Elongation ist langsam und ineffizient
2) Arretierung des Promotors/Pausieren/Kettenbruch: negative Transkriptionptionsfaktoren assoziieren mit RNAP II und verhindern produktive Elongation; 5ˋ-Capping von RNA-Transkript findet hier statt ; Phosphorylierung von DSIF und RNAPII CTD am Ser 2 durch P-TEFb ->Dissoziation von NELF
3)Produktive Elongation
Welche der RNAPs haben eine Faktor-abhängige und welche eine unabhängige?
RNAP I & II sind Faktor-abhängig und RNAP III ist Faktor-unabhängig
Was passiert bei der Faktor-abhängigen Termination ?
RNAP II braucht spezifisch hergestellte RNA-Sequenz mit Spaltstelle und Polyadenylierungssignal
-> Termination ist Polyadenylierung verbunden
-CPSF bindet transkribierende RNAP II, CstF an Phosphorylierung an CTD Ser 2
CPST induziert RNAPII-Pausierung -> interagiert mit CstF-> verlässt danach RNAPII und spaltet per-mRNA
Was passiert bei der Faktor-unabhängigen Termination ?
Terminatorsignal besteht aus mehreren Thyminresten
->Poly(T)-Terminatorsignal pausiert RNAP III und bewirkt zurückgehen zur dichtesten Haarnadel -> Dead-End-Komplex wird gebildet
- RNA-Haarnadel öffnet allosterisch RNAP III und bewirkt Zerfall von Elongationskomplex
Welche Antibiotika hemmen bei der Transkription? (Eukaryonten)
Actinmycin D inhibiert Eukaryotische RNAP durch Bindung an dsDNA
Alpha-Amanitin inhibiert RNAP II und III aber nicht I oder bakterielle RNAP
Welche DNA-bindenden Domänen gibt es ?
-Homeodomaine
-RRMs : RNA-Erkennungsmotiv
-Leucinzipper
-Basic Helix-Loop-Helix
Wie wird die Genexpression bei Eukaryonten geregelt ?
-hauptsächlich nur durch Aktivatoren und nicht durch Repressoren geregelt
-meisten Gene sind monocistronisch
-> Manche TF aktivieren mehrere Gene, aber meistens Gene reguliert durch mehrere TF -> kombinierte Kontrolle
(Beispiel Leucin-Zipperlein-Proteine )
Beschreibe den Mediatorkomplex.
-ein Koaktivator
-besteht aus sehr vielen kleinen Protein U.E (über 20 stk.)
-verbindet RNAP II und transkritionale Regulatoren
-wichtig für Formation des Pre-Initiator-Komplex (PIC)
-> positioniert RNAPII an Transkriptionsstelle
(Bevor Produktiv RNA-Synthese erfolgt muss Mediatorkomplex dissoziieren -> durch phosphorylierung an CTD Ser 5)
-GTFs und Mediator bleiben an Promoter um neue RNAPII zu rekrutieren (GTFs interagieren mit Mediatorkomplex)
Wie wird die Genexpression über die Chromatinkondensation reguliert ?
Zwei verschiedene Formen möglich des Chromatins möglich:
1) Heterochromatin: in Nukleus verstreut; meist vorliegend in weniger aktiven oder unaktiven Teilen
2)Euchromatin: zerstreut und offen vorliegend; prevalent in Zellen die aktiv Transkription machen
Welche drei Punkte sind wichtig bei dem Chromatinremodeling ?
1) Nukleosome Positionierung (Nukleosomzusammensetzung ist ATP-abhängig
-> SNF Familie & Bromodomainen binden an Acetylierte Histonschänze, dies wirkt Transkriptionsaktivierend;
SWI ist Transkriptionsinaktivierend
2) Histonmodifizierung: nur Transkriptionsaktivierend
3) Histonchaperone (ATP-unabhängig): HIRE
Wo geschehen die Histonmodifizierungen ?
-meistens an Histonschwänzen (liegen ansich ungeordnet und bilden Kontakt zu Nukleosomen)
-> Modifikationen dienen als Erkennungsstelle für spezifische Proteindomainen, welche die Chromatinstruktur ändern oder Transkription fördern
Modifikationen z.B Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinilierung, Glykosylierung
-Effekt ob Repression oder Aktivierung abhängig, welcher Lysinrest welche Modifikation erfährt
Woraus setzt sich der Epigenetische Code zusammen ?
Von welchen Enzymklassen werden sie erhalten (+Beispiele)
Histonmodifizierung und DNA-Methylierung
(Informationen werden an Generationen weitergegeben, aber nicht in DNA codiert
-writers (Acetyltransferasen, Methyltransferasen, Kinase…)
Erasers(Deacetylasen, Phosphatasen, Demmethylasen…)
Reeders(Bromodomainen, chromodomainen, Tudor, WD40
Findet prosttranslationales RNA-Prozessing in Prokaryonten statt ?
Eigentlich nur bisschen oder keine Prouüzessierung, aber einige tRNAs und 30S rRNA werden durch Splicing und Modifizierung hergestellt
Beschreibe die 4 unterschiedlichen RNAse-Klassen
1) hauptsächlich in Bakterien und Bakteriophagen ; besitzt RNAse III domaine und dsRNA Bindedomaine; prozessieren Vorläufer von rRNA, snRNA, snoRNA
2) in Pilzen ; N-Terminale Domaine, RNAse III Domaine und dsDNA Bindedomaine ; prozessieren Vorläufer von rRNA, snRNA und snoRNA
3) Droshafamilie von Enzymen; prozessieren Vorläufer von miRNA
4) Dicerfamilie von Enzymen; Funktion von RNA-Interferenz
Was gehört alles zum posttranskriptionale. RNA-Prozessing von Eukaryonten ?
-5ˋ-Capping
- Intron und Exonentfernung = Splicing
-3ˋ-Polyadenylierung
-> umfangreiches Prozessieren von Eukaryontischer mRNA-Primärtranskripts
Was passiert beim 5ˋ-Capping in der Prozessierung von Euk. RNA ?
Das RNA-Transkript bekommt methylierte Guanosinkappe aufgesetzt (schon co-transkriptional)
-> stabilisiert Transkrit und wird benötigt für mRNA Prozessierung und nuklearem Export und Translation
Was passiert grundlegend beim Splicing in Eukaryonten ?
-Höhere Eukaryonten haben nur 1,5 % Exons -> Introns müssen gesplittet werden
(4 verschiedene Arten von Introns)
-gespliect wird meistens durch das Splicosom
Beschreibe das Splicosom mit (ohne Untereinheiten)
-ist ein multipler RNA-Komplex, welches aus small Nuklear ribonukleoproteinen (snRNPs =Snurps) besteht
-meiste Splicevarianten durch Lariatforming = Gruppe 2 Intron splicemechanismus gespliced
- besitzt am 5ˋ-Ende ein GU und am 3ˋ- Ende ein AG
-ATP benötigt zum Zusammensetzen, aber nicht für die Splatreaktion selber
Beschreibe Funktion der U.E des Splicosoms und den Ablauf (2 Reaktionen)
-U1 bindet an 5ˋ-Splicestelle
-U2 bindet Branchstelle und formt katalysitisches Zentrum
-U4 markiert katalytische Aktivität von U6
-U5 bindet 5ˋ-Splicestelle
-U6 Splicosom katalytisch
-> U2 und U6-Helix-katalytisches Centrum des Splicosomens
1. Transesterfikation: dadurch Formation von Lariatstruktur zu P und A und Spaltung von 5ˋ-Exon
2. Transesterfikation: Reorientierung von Exon 1 zu Exon 2, dadurch 3ˋ-OH von Exon 1 attackiert 3ˋ-Spaltstelle: Intron als Lariatstruktur frei
-> U2, U5, U6 und Intron dissoziieren mit Hilfe von NTP
Unterschied zwischen Klasse 1, Klasse 2 und Klasse 4 Introns ?
-Klasse 1 : selbst-Splicing -> kein Proteinenzym beteiligt ; komplizierte RNA-Struktur mit Helices und Loops und IGS (Internal Guide Sequenz)
-Klasse 2: selbst-Splicing, braucht keine Enzyme -> Ausbildung von Lariatstruktur
-Klasse 4: Splicing benötigt ATP und Endonuklease, ähnlich wie DNA-Ligase-Reaktion
Wofür Poly-A-Schwanz bei Eukaryonten und wie ?
-Poly(A)-Schwanz von circa 50-100 Adeninresten angefügt
-startet nach CPSF
-Bindestelle für spezielle Proteine ->koordinieren Transkription/Translation und schützt durch Stabilisierung durch Enzymatischen Abbau
-Pol(A) von Poly(A) bindendem Protein gebunden, was wichtig ist für Export aus Nukleus und Translation
-snRNA & Histoncodierende mRNA werden nicht Poly-adenyliert (-> werden zu pre-snRNA durch Integratorkomplex gespalten
-durch poly(A)Polymerase unter ATP-Verbrauch angehängt
Welche verschiedene Splicevarianten gibt es ?
1) Konstitutives sp.
2) Exon Skipping
3) Intron Retention
4) Mutually Exclusive Exon
5) Alternative 5ˋ splice Stelle
6) alternatives 3ˋ splicestelle
Beschreibe den NPC.
-ermöglicht nuklearen Export
-circa 1000 NPCs in Zelle
- jedes NPC beinhaltet min. 456 Individuals Proteinmoleküle und bilden ein Tor
-jedes NPC kann aktiv 1000 Moleküle pro Sekunde translozieren
Beschreibe den Transport durch den NPC.
2 Typen von Signalen:
-NLS = Nukleare Lokalisierungsequenz um in den Nukleus zu kommen (Stretch aus positiv geladene AS auf Proteinoberfläche)
-NES = Nuklearer Exportsequence um aus Nukleus rauszukommen; beinhaltet hydrophobe AS
-Export: RanGTP bindet Exportin -> Konformationsänderung in Exportin-> erhöht Affintät zur Ladung; alles drei durch Pore
-Import: NLS/Ladung wird erkannt von Importin -> bindet und wird durch Pore importiert -> Ladung freigelassen durch RanGTP
Was ist Ran ?
-Ran ist eine kleine GTPase:
Hydrolyse welche GTP bindet und zu DDP hydrolisiert
Z.B Ras, Rho &Rop, Arf &Rab, Ran, EFs…
Was machen FG-Nukleoporine ?
NPC ist eine selektive Barriere zw. Nukleus & Cytoplasma und separiert Transkription und Translation
-> FG-Nups koordinieren und regulieren NPC Translokation und verhindern das Pendeln zufälliger Moleküle
