Transfection Flashcards
Quel est le but de la transfection ?
etudier un gène, un promoteur, un arn ou une protéine (constituants de la cellule) en permettant la surproduction d’une protéine.
Que faut-il faire avant de transférer un gène dans une cellule ?
Le cloner avec un vecteur d’expression.
est-il possible de modifier un gène après que le transgène a été inséré ?
Oui !
Donner trois métodes pour transférer un vecteur d’expression.
Physique : électroporation
Chimique : cations lipidiques (ex phosphate de calcium)
Biologique : agrobactérium, vecteur viraux.
Qu’est-ce que la transduction des cellules ‘
Lorsqu’on utilise des vecteurs viraux (rétrovirus) comme vecteur de transfert
Un vecteur d’expression doit comporter deux parties : lesquelles ?
Une permettant la surproduction du plasmide dans les bactéries et une autre permettant l’expression du transgène dans les cellules.
Qu’est-ce que doit contenir le plasmide pour pouvoir répliquer dans les bactéries ?
une origine de réplication
Comment être sûr de séletionner uniquement des bactéries avec le plasmide ?
On y inclut un gène de résistance à un antibiotique.
Pour permettre l’expression du transgène dans les bactéries, il faut 4 composants : lesquels ?
Promoteur
Terminateur
ADN complémentaire
Séquence polyadéniation
Quels promoteurs permettent une expression forte du gène ?
Viral et promoteur cellulaire actine.
Quels promoteurs permettent une expression spécifique d’un type cellulaire particulier ?
Promoteur albumine.
Quel promoteur est dit inductible, c’est à dire qui permet l’expression du gène qu’après que le promoteur soit libéré d’un répresseur ?
Promoteur tet-on/off.
Comment décider de quand le répresseur libère le promoteur ?
En utilisant des antibiotiques spécifique, comme la tétracycline.
Comment étudier un promoteur ?
Il faut un gène rapporteur induisant l’expression d’une protéine rapportrice, marquée avec une enzyme (luciférase, galactosidase) ou fluorescente) qui quantifiera l’activité du promoteur.
Donner les deux types de transfection.
Transitaire : diminue au cours du temps car plasmide mal transmis au cours des divisions.
Stable : transgène mieux incorporé au génome grâce à l’utilisation de rétroviraux, ou de la recombinaison homologue, ou encore sys CRISPR/Cas9.
Comment fonctionne l’électroporation ?
Crée pores au niveau des membranes plasmiques et nucléaire par courant électrique. ADN/plasmide rentre par ce pores.
Comment fonctionne le phosphate de calcium / liposomes cationiques ?
Change charge de l’acide nucléique de - à + pour permettre endocytose par la membrane chargée -.
Comment fonctionne la méthode de transvection par vecteurs rétroviraux ?
On produit un virus avec 3 plasmides, un produisant l’ARN à encapsider (qui a l’expression du gène à surexprimer), l’autre produsant les enzymes nécessaires (réplicase) et la troisième formant les protéines d’enveloppe du virus pour permettre l’interaction avec les cellules. Le virus formé ne contient que l’ARN du gène ciblé, et donc ne peut pas faire d’autres virus. Il peut alors entrer dans une cellule et se servir de ses rétrotranscriptases pour faire exprimer le gène par la bactérie.
Quel limite observe-t-on avec ces techniques d’intégration ?
On ne peut pas prévoir ou est-ce que le gène va être intégrer dans le génome de la cellule !
