TP - Microscopia

Question 1

Microscopia utilidades

Answer 1

• Ferramenta para diagnóstico clínico
• Patofisiologia da doença
• Diagnósticos diferênciais
• Custo-efetividade; acessibilidade diagnóstica
• Prognóstico (oncologia)
  -Ferramenta para investigação (celular, biomoléculas ou biomateriais)

Question 2

Tipos de microscópio

Answer 2

-Ótico
-Eletrónico

Question 3

Tipos de microscopia ótica

Answer 3

Campo claro
Campo escuro
contraste de fase
fluorescencia

Question 4

Tipos de microscopia ótica fluorescencia

Answer 4

Confocal
Super resolução

Question 5

Tipos de microscopia eletrónica

Answer 5

transmissão
varrimento
Cryo-em

Question 6

microscopia ótica utiliza …

Answer 6

Luz visível

Question 7

Componentes do microscópio ótico

Answer 7

Componente mecânica
-> suporte e controlo
Componente ótica
-> sistema de lentes que amplia a imagem -> luz incide na amostra

Question 8

Lentes da objetiva e ocular

Answer 8

focar e ampliar a imagem da amostra iluminada

Question 9

Limite de resolução

Answer 9

Limite de resolução: distância minima entre 2 pontos distintos 2µm

Question 10

Condições essenciais para microsecopia de qualidade:

Answer 10

garantir a proximidade maior possível da realidade
-> contraste, ampliação e resolução

Question 11

Preparação de amostrar para microescopia:

Answer 11

Propriedade: espessura de poucos µm
Amostras fixadas em parafina e processadas num micrótomo

Question 12

Modificação das propriedades da luz:

Answer 12

Refração, reflexão e polarização

Question 13

Limite de Resolução

Answer 13

Distância minima de observação entre 2 pontos distintos
→ abertura numérica (AN) das lentes AN=nsin(Ø)
Resolução: 0.61λ/AN limite de resolução sin(ø)=1

Question 14

Microscópio de contraste de fase:

Answer 14

Imagens de grande contraste: amostras biológicas não coradas (transparentes)
- transforma pequenas variações de fase em variações de amplitude (para distinguir entre material biológico e o meio envolvente)
→ imagem nítida e detalhada da estrutura da célula

Question 15

Microscópio de contraste de interferência diferencial:

Answer 15

aumenta o contraste em amostras biológicas e materiais não manchadas. Funciona usando luz polarizada para criar um padrão de interferência, o que aumenta o contraste de espécimes transparentes.
Condensador é um prisma

Question 16

Fluorescência utilização:

Answer 16

Identificação de componentes celulares específicos:

Question 17

Fluorescência luz:

Answer 17

Luz refletida e não transmitida
A absorção de luz de excitação e emissão de radiaçãoluz é quase simultânea → reação rápida quando excitadas

Question 18

Fluorescência primária

Answer 18

Autofluorescência: natural das substâncias presentes num tecido colagénio

Question 19

Fluorescência secundária

Answer 19

Induzida: → utilização de corantes fluorescentes específicos - fluorocromos: marcar determinadas estruturas/componentes celulares

Question 20

Imunofluorescência

Answer 20

Um sinal mais forte é obtido se a imunofluorescência for indireta → ou seja nos anticorpos secundários

Question 21

Vantagem Imunofluorescência

Answer 21

Podemos ampliar o sinal

Question 22

Imunofluorescência: processamento de imagem

Answer 22

Marcar o sinal por comprimento de onda e depois combinar todas as imagens

Question 23

Microscopia confocal

Answer 23

Obtenção de imagens de eventos biológicos que ocorrem in vivo

Question 24

Microscopia confocal metodologia

Answer 24

→ com um “pinhole” e um espelho podemos focar

→ em vez de um LED temos um laser que incide sobre um orifício “pinhole”: plano de focagem só num ponto

→ depois a imagem é processada: Desconvolução de imagem: abordagem computacional para melhorar a definição e contraste

Question 25

FRAP definição

Answer 25

Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento:

Question 26

FRAP procedimento

Answer 26

- Analisa o que acontece quando se remove o florocromo → análise de como recupera progressivamente - A recuperação da fluorescência ao longo do tempo indica a difusão e a ligação das moléculas.

Question 27

FRET definição

Answer 27

Transferência de energia de ressonância Förster

Question 28

FRET procedimento

Answer 28

- Determinar as interações proteína-proteína em células vivas - A transferência de energia ocorre entre duas proteínas fluorescentes (CFP e YFP), permitindo aos investigadores medir a proximidade da interação entre as moléculas - Biossensores para estudar processos moleculares dinâmicos, como a atividade da quinase → tiram e adicionam fosfato - Análise in vivo → elas aproximam-se para interagir e os sinalisadores de fluorescencia interagem

Question 29

Microescopia de super-resolução (SRM) geral

Answer 29

- Capazes de superar o limite de resolução ótica → Resolução: nm → Nível de detalhe: superado apenas por ME

Question 30

vantagens de Microescopia de super-resolução (SRM)

Answer 30

→ Preservação da amostra → Flexibilidade na imagem → Especificidade do alvo

Question 31

SIM

Answer 31

Structured illumination microscopy Amostra é iluminada com um padrão de riscas claras e escuras em várias orientações gera padrões de interfrência

Question 32

STED

Answer 32

Stimulated emission depletion excitação ponto-a-ponto, feixe laser de excitação é rodeado por pulso de 2º laser para depleção → reduz a área

Question 33

PALM

Answer 33

Photo-activated localisation microscopy Deteção e localização de moléculas únicas → correção de sobreposição da curva Gaussiana → fotoativação de molécula GFP permitindo a sua localização

Question 34

Microescopia eletrónica geral

Answer 34

- Utiliza um feixe de eletrões que irá interagir com a amostra - Maior voltagem → maior acelaração - Quanto mais se diminui λ maior a resolução

Question 35

TEM

Answer 35

- Microscopia eletrónica de transmissão

Question 36

TEM informações

Answer 36

- Invertido, maior em escala do que o ótico, fonte de iluminação fora do espectro visível - Fonte de iluminação: filamento que emite eletrões - Informações sobre ultra-estrutura (organelos) da amostra - Imagens 2D da superfície da amostra - Cortes finos - Processamento mais complexo

Question 37

Marcação de proteínas por immunogold

Answer 37

- Equivalente à técnica de imunofluorescência indireta para a luz visível - Particulas de ouro→ anticorpos secundários→anticorpos primários - Ouro: elevada densidade eletrónica que aumenta a dispersão dos eletrões → “manchas escuras” de elevado contraste

Question 38

SEM

Answer 38

Microscopia eletrónica de varrimento

Question 39

SEM procedimento

Answer 39

- Visualização em 3D da superfície das amostras - Não permite ver a ultra-estrutura (organelos) da amostra - Resolução mais baixa → Processamento mais simples - Espessura da amostra não é crítica

Question 40

SEM eletrões

Answer 40

- Feixe de eletrões focado, percorre ponto por ponto, linha a linha → eletrões secundários ou retro difundidos pela amostra são convertidos em sinal por detetores, por forma a criar uma imagem de pixéis

Question 41

Eletrónica criogénica geral

Answer 41

- Envolve o arrefecimento ultrarrápido da amostra a temperaturas criogénicas: vitrificação - Impede a formação de cristais de gelo → fica com a estrutura natural - Arrefecimento com etanol

Question 42

Eletrónica criogénica: Imagem

Answer 42

- Capturada várias vezes com orientações distintas → projeção de imagens distintas → São depois reconstruídas como modelo tridimensional

Question 43

Força atómica modos

Answer 43

Modo contato e modo ressonante/não contato/dinâmico

Question 44

Modo contato

Answer 44

- Sonda com uma ponto muito fina - Forças de interação entre os átomos de superfície e a ponto → força resultante varia durante o varrimento

Question 45

Modo ressonante/não contato/dinâmico

Answer 45

- Fornece imagem 3D da superfície, maior resolução que o SEM - Materiais biológicos não condutores - Tem uma preparação mais complexa → não é necessário ser realizado em vácuo nem materiais de revestimento da amostra