PL 2 - Técnicas de Processamento MO e TEM Flashcards
1º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Colheita 1D ≤ 1mm
2º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Fixação: Preserva a estrutura e composição química dos tecidos, prevenindo a degradação e autólise, mantendo a morfologia celular para análise microscópica.
Fixadores diferentes para tecidos animais e vegetais (1)
- Composição celular e estrutural:
Animais: membranas celulares flexíveis
preservar estruturas protegendo as proteínas e os ácidos nucleicos
Plantas:
paredes celulares rígidas e compostas por celulose, que exigem fixadores mais fortes ou diferentes; outros componentes como cloroplastos, vacúolos
Fixadores diferentes para tecidos animais e vegetais (2)
Ação dos fixadores:
para penetrar nas paredes celulares vegetais rígidas e preservar as estruturas como cloroplastos, amido e outras organelas vegetais. Muitas vezes, eles precisam de maior força ou tempo de fixação devido à resistência das paredes celulares vegetais
Exemplos de Fixadores
- Tecidos vegetais: FAA
- Tecidos animais: Formol, Fixador de Bouin, Fixador de Carnoy
3º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Lavagem: Remoção de excessos de fixador ou substâncias contaminantes.
4º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Desidratação: Série ascendente de etanol Substituição da água do tecido por etanol -> parafina é um solvente orgânico hidrofóbico
Depois Xilol: para preparar o tecido para a impregnação com parafina Ethanol também não reage com paragina
5º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Impregnação: Em parafina, podendo iniciar-se com banhos de parafina dissolvida
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Inclusão em blocos de parafina para permitir o corte
7º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Corte no micrótomo (4-10 μm) fatias finas para observação.
8º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Desparafinação: Xilol (≈ 10 minutos) para permitir a interação com os reagentes durante a coloração
9º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Re-hidratação: Série descendente de etanol
10º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Coloração
11º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Desidratação: Série ascendente de etanol: etanol a 50%, 75%, 90%, 95% e etanol absoluto
12º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Diafanização: Xilol
tornar tecidos biológicos mais transparentes,
13º Passo
Processamento de amostras biológicas para Microscopia óptica
Montagem: Resinas Naturais (Bálsamo de Canadá) ou Resinas Sintéticas (DPX, Entelan)
Tissue microarray
Consiste em blocos de parafina, onde até 1000 porções de tecidos são montados em forma de matriz para permitir a análise histológica multiplex.
Tissue microarray/Técnica desenvolvida para colmatar:
- disponibilidade limitada de reagentes para diagnóstico
- dimensão limitada da amostra do paciente
Tissue microarray procedimento
- agulha oca para remover pequenas porções de tecido
- inseridas num bloco de parafina recetor com um padrão de matriz
- Secções deste bloco são cortados usando um micrótomo, montadas sobre lâmina
1º Passo:
Processamento para TEM
Colheita: Em geral, fragmentos não maiores que 1 mm^3
2º Passo:
Processamento para TEM
Fixação: glutaraldeído a 2,5% diluído em tampão: 2h
3º Passo:
Processamento para TEM
Lavagem: Tampão: mínimo 2h
4º Passo:
Processamento para TEM
Pós-fixação: Tetróxido de ósmio (OsO4) a 2% diluído em tampão: 2h
5º Passo:
Processamento para TEM
Desidratação: Etanol crescente
