Tema 6 - Técnicas de PCR

Question 1

PCR (definición)

Answer 1

Técnica enzimática in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde

Question 2

Cebadores (concepto)

Answer 2

Son cadenas simples de olignonucleótidos cuya secuencia es complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar y son necesarios para la actividad polimerasa

Question 3

Cebadores F y R

Answer 3

• Forward: el unido a la cadena 5’-3’

- Reverse: el unido a la cadena 3’-5’

Question 4

Cebadores (características ideales)

Answer 4

• Longitud: entre 18 y 30 pb, el tamaño adecuado para garantizar una especificidad adecuada y no entorpecer el rendimiento del proceso. Mínimo de 16 pb para que se considere específico
• Composición de bases: ricos en G+C

Question 5

ADN polimerasas (definición)

Answer 5

Enzimas que catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5’-3’ utilizando como molde ADN monocatenario y en presencia de iones Mg2+

Question 6

ADN polimerasas (características ideales)

Answer 6

• Actividad polimerasa óptima a 70-75ºC
• Capacidad para mantener su capacidad polimerasa de 95ºC durante más de 40 mins

Hay variedades que poseen actividad exonucleasa en uno u otro sentido o que incluso poseen actividad transcriptasa inversa

Question 7

ADN polimerasa más utilizada en PCR

Answer 7

Thermus aquaticus - Taq ADN polimerasa, posee actividad exonucleasa únicamente en sentido 5’-3’, velocidad de replicación 60 nucleótidos/s

Question 8

Fases del proceso PCR

Answer 8

Desnaturalización inicial: debe cerciorarse de que la cadena quede totalmente desnaturalizada

1. Desnaturalización del ADN molde (95 ºC 15-30 segs)
2. Hibridación/anillamiento de los cebadores con el ADN molde (50-65 ºC)
3. Extensión/elongación (72ºC)

• Fase de extensión final: corrobora que todos los productos PCR están completos y en forma de doble hélice
• Fase de mantenimiento: Incubación a 4ºC que desactiva la actividad enzimática y se mantiene hasta que las muestras sean retiradas

Question 9

Cálculo de PD y PND

Answer 9

• PD (amplicones): 2^n-2n

- PND: 2n

Question 10

Mezcla de reacción PCR

Answer 10

• Tampón (aporta las condiciones de pH óptimas para la reacción, TRIS los más utilizados)
• ADN polimerasa (usualmente preparada en glicerol)
• dNTPs (cada uno en la misma proporción)
• ADN molde
• Cebadores
• Mg2+ (principalmente proveniente del MgCl2)

Question 11

Consideraciones sobre el ADN molde

Answer 11

• Calidad del ADN molde: el valor de absorbancia a 260 nm debe estar en el intervalo 1,7-2 para asegurar su pureza, la cadena debe mantener su integridad
• Cantidad de ADN molde: dependerá de la complejidad del material genético que se quiera obtener

Question 12

Soluciones a problemas de rendimiento en la PCR

Answer 12

Las bajadas de rendimiento se deben a la presencia de contaminantes o a la inespecificidad de los cebadores, para prevenirlas es posible añadir a la mezcla de reacción glicerol o polietilenglicol

Question 13

Volumen final mezcla PCR

Answer 13

25 o 50 microlitros = 1 microlitro ADN molde + x microlitos componenetes + resto agua de grado PCR/mili-Q

• La cantidad de cada componente se multiplica por el número de muestras que se van a procesar simultáneamente + 1
• Debemos tener en cuenta la necesidad de tener dos muestras de control (negativo y positivo)

Question 14

Adición del ADN a la mezcla PCR

Answer 14

Es conveniente realizar este paso en último lugar para minimizar las probabilidades de contaminación

Question 15

Consideraciones durante el análisis de los productos amplificados

Answer 15

• Preparamos de antemano un control positivo (tubo con ADN de control que contenga aquel fragmento que queramos amplificar) y uno negativo (mezcla máster sin material genético)
• Preparamos los carriles de la máquina de electroforesis reservando 3 carriles (muestra patrón, C+ y C-)

Question 16

PCR convencional

Answer 16

Amplificamos un único fragmento de ADN, por lo que requerimos una única pareja de cebadores

Question 17

PCR con inicio en caliente

Answer 17

Para evitar la aparición de PND, relacionada principalmente con la naturaleza de los cebadores, evita que estos se unan entre sí formando dímeros que puedan afectar al rendimiento del proceso

Question 18

PCR de alta fidelidad

Answer 18

Son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones mutaciones puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos. Se utilizan en estudios de expresión génica o en clonación

Question 19

PCR anidada

Answer 19

El producto final de la primera PCR es el producto utilizado en una segunda PCR. En la primera utilizamos unos cebadores R/F externos y en la segunda unos cebadores R/F internos lo cual origina una serie de copias fieles. Se utiliza para aumentar tanto la sensibilidad como la especificidad

Question 20

PCR múltiple

Answer 20

Consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente en el mismo tubo con una sola reacción de PCR, se consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para una región diferente

Question 21

PCR con transcripción inversa/RT-PCR

Answer 21

Permite amplificar y analizar moléculas de ARNm, requiere el empleo de retrotranscriptasas como paso previo

Question 22

PCR a tiempo real/qPCR/Q-PCR

Answer 22

Permite obtener resultados cuantitativos a tiempo real, se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes cuya intensidad va a ser proporcional a la de la cantidad de ADN sintetizado. Permite una mayor sensibilidad y no requiere electroforesis pero requiere de un termociclador a tiempo real que incorpore un lector de fluorescencia

Question 23

Zonas de la curva de amplificación

Answer 23

• Zona o fase de ruido: la única fluorescencia que se detecta es debida a la señal fluorescente de fondo en cada tubo, corresponde a los 3 primeros ciclos de la PCR
• Zona o fase de crecimiento exponencial: abarca 4-6 fases y supone un rápido incremento en el número de amplicones
• Zona o fase de meseta: zona de pendiente reducida debido a la drástica disminución del rendimiento en los últimos ciclos de la PCR

Question 24

Sistemas de detección independientes de secuencia (concepto)

Answer 24

Se basan en el empleo de agentes intercalantes fluorescentes (sustancias que aumentas de fluorescencia cuando se intercalan con el ADN formando una doble hélice). Sufren de una baja especificidad ya que se pueden asociar a PND, dímeros de los cebadores o a PD. SYBR Green

Question 25

Sistemas de detección específicos de secuencia (concepto)

Answer 25

Se basan en la utilización de sondas oligonucleótidas marcadas con fluorocromos que hibridan de manera específica en la región central del amplicón. La fluorescencia solo se asocia con los PD lo que aumenta la especificidad del proceso

Question 26

Principio FRET

Answer 26

Se usan dos fluorocromos acoplados a la sonda, un donante/notificador que se excita a una longitud de onda determinada y que en lugar de emitir fluorescencia transmite la energía a un segundo fluorocromo denominado receptor/quencher/aceptor que se excita y la emite.

Una variante de este proceso incluye quenchers no fluorescentes que inhiben la fluorescencia del primer fluorocromo y que al ser eliminados le permiten emitirla

Question 27

Sondas empleadas

Answer 27

• Sondas de hidrólisis (TaqMan): donante/noticador 5’ y aceptor 3’. Se detecta al final de la fase de extensión
• Balizas moleculares: donante/aceptor 5’ y aceptor/quencher 3’, ambos extremos son secuencias cortas repetidas e invertidas que hibridan conformando un bucle. Se detecta al final de la fase de hibridación
• Sondas Fret: donante/notificador 3’ y aceptor/quencher 5’ que interaccionan entre distintos fragmentos de PD. Se detecta al final de la fase de hibridación