Tema 3 - Extracción y purificación de los ácidos nucleicos Flashcards
Necesidad de pretratar las muestras biológicas
Buscamos obtener suspensiones celulares que están formadas por células libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de un medio líquido
Muestras de sangre para extracción de ADN
Partimos de una muestra de sangre anticoagulada con EDTA, heparina o citrato sódico
Pretratamiento de la sangre
- Lisis de los hematíes
- Centrifugado de la muestra
- Eliminación del sobrenadante (componentes del plasma y la hemoglobina)
- Conservación del sedimento (leucocitos)
Obtención de células mononucleadas de sangre periférica
- Se coloca en el tubo un medio de separación (con polisucrosa que agrege los hematíes) y encima la sangre
- Centrifugado de la muestra
- Se elimina el plasma sobrenadante y se aspira la capa de células mononucleadas, por debajo quedan el medio de separación y los granulocitos y hematíes agregados
- Se lavan las células mononucleadas con tampón o solución salina para eliminar restos de plasma y plaquetas y se continua con el proceso
Pretratamiento de cultivos celulares en suspensión
- Se recolecta el tubo
- Se elimina el medio de cultivo mediante centrifugación
- Se lavan las células con tampón o suero fisiológico
Pretratamiento de cultivos celulares en monocapa
- Utilizando el propio frasco
1. Retirar el frasco del medio de cultivo
2. Lavar la monocapa con tampón o solución salina
3. Iniciar in situ el proceso de extracción - Pasando la monocapa a un tubo
1. Despegamos la monocapa de células de la pared del frasco con un raspador o una solución de tripsina
2. Recolectamos las células en un tubo
3. Lavamos las células antes de continuar con la extracción
Pretratamiento en tejidos animales o vegetales frescos
Consiste en la homogeneización, el tratamiento al que se somete el tejido para liberar las células que lo integran
Homogeneización mecánica
- Homogeneización mecánica automatizada
1. Se corte en pequeños fragmentos el tejido y se homogeneiza por medio de trituradores, agentes abrasivos, sonicadores….
2. Se transfiere a un tubo limpio para iniciar la extracción - Homogeneización mecánica manual con mortero:
1. Se cubren los fragmentos de tejido con N2 líquido
2. Se pulverizan los fragmentos con ayuda del mortero hasta conseguir un polvo fino y se deja evaporar el N2
3. El polvo se transfiere a un tubo para comenzar la extracción
Homogeneización química
- Se añade la muestra a la mezcla de incubación que contiene las proteasas y detergentes para la digestión del tejido
- Se lleva la muestra a la incubadora, pasado el tiempo de incubación se retira y se sigue con la extracción
Pretratamiento de tejidos en formol e incluidos en parafina
- Se obtienen cortes finos de 5-10 micras
- Se transfieren unos 5-10 cortes a un tubo eppendorf
- Se incuba secuencialmente con xilol u otro agente desparafinante, etanoles de concentración decreciente (100-96-70 %) y agua destilada
- El tejido desparafinado y rehidratado se somete a una homogeneización química
Pretratamientos de cultivos de bacterias y levaduras
- En medio líquido
1. Se centrifuga el tubo para eliminar el medio de cultivo sobrenadante
2. El sedimento se resuspende en el tampón de suspensión - En medio sólido
1. Se recoge una colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril
2. Se resuspende la colonia en el tapón de suspensión
Pretratamiento de células de la mucosa oral
- Mediante raspado con torunda o cepillo
- Mediante enjuage con una solución conservante (NaCl 0,9%(
- Recolectando directamente la saliva
Pretratamiento de muestras de esputo
Fluidificación con un agente mucolítico del tipo NALC en una disolución de citrato sódico. Si el microorganismo que se quiere detectar es una microbacteria se puede aádir hidróxido sódico como descontaminante.
Solución de lisis para la extracción de ácidos nucleicos
Detergentes: desestructuran la bicapa lipídica y desnaturalizan las proteínas que se insertan en ellas efectuando la lisis celular (SDS en animales)
EDTA: agente quelante que al atrapar los cationes de Mg inhibe la actividad de las ADNasas
Proteasas: como la proteinasa K que digiere las proteínas membranales facilitando la rotura de tales estructuras y elimina las nucleasas
Agentes caotrópicos: modifican las interacciones intramoleculares no covalentes. Isotiocianato de guanidinio, un potente inactivador de ARNasas
Tratamientos adicionales en células con pared celular
Tratamiento enzimático: lisozima (degrada la pared de bacterias gram positivas) y liticasa (para células vegetales, levaduras y hongos)
Tratamiento mecánico: es posible causar en bacterias la ruptura de la pared con medios tales como ebullición, ciclos de congelación, sonicación…
Tratamiento con CTAB: detergente más potente que el SDS para células con alto contenido de polisacáridos y polifenoles que puedan interferir
Consideraciones en la extracción del ADN
Es posible purificar exclusivamente ADN añadiendo al medio de reación ARNasa A. No es necesario en muetras de sangre periférica o médula
Purificación con solventes orgánicos
- Eliminación de los compuestos solubles en solventes orgánicos (fenol, cloroformo y alcohol isoamílico). Se centrifuga y quedan un sobrenadante acuoso (ácidos nucleicos, sales minerales y componentes hidrosolubles) y una fase orgánica (proteínas y lípidos)
- Precipitación del ADN: se transfiere la fase acuosa a un tubo limpio y se precipita el ADN añadiendo acetato sódico y etanol al 100%, se centrifuga y el sobrenadante con todos los contaminantes hidrosolubles es eliminado
- Lavado del ADN: se lava con alcohol 70% y se vuelve a centrifugar, el ADN queda como sedimento y los restos de sales y posibles contaminantes solubles en etanol se eliminan con el sobrenadante
- Resuspensión del ADN: se eliminan los restos de etanol y se resuspende con agua destilada o tampón tris-EDTA
Purificación mediante precipitación con sales
- Precipitación de proteínas: se añade al lisado una solución salina concentrada que precipita las proteínas y se centrifuga
- Precipitación del ADN: el sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y se añade etanol para provocar la precipitación del ADN, volvemos a centrifugar
- Lavado y resuspensión del ADN: se elimina el sobrenadante y el ADN se lava con etanol 70% y se resuspende en agua destilada o tampón TE
Purificación mediante cromatografía de adsorción
Utilizamos columnas de polipropileno en cuyo interior colocamos membranas de lana de vidrio o perlas de sílice conectadas a un tubo colector.
Al centrifugar se adhieren los ácidos nucleicos a las membranas, añadimos etanol 70% para lavar el resto de contaminantes
Purificación mediante esferas magnéticas
- Microesferas magnéticas se recubren con grupos funcionales con alta afinidad con el ADN
- Al aplicar un campo magnético estas esferas se ven atraídas arrastrando con ellas el material genético que buscamos
Ultrafiltración
- La muestra (generalmente mezcla de reacción de PCR) se carga directamente en la columna y se centrifuga de manera que al tubo colector pasan solo los contaminantes
- El filtro se lava con etanol 70% para eliminar restos de contaminantes
- Añadimos a la columna agua destilada o tampón TE para resuspender los productos de PCR
Cromatografía de intercambio iónico
Se basa en la unión electroestática reversible de los iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria
Tratamiento del agua para estos procesos
Debeos utilizar exclusivamente agua destilada tratada con dietilpirocarbotano (DEPC) al 0,1% que la libra de ARNasas (método estándar)
Comprobación de la integridad de los ácidos nucleicos
Realizamos electroforesis en gel de agarosa, en las muestras íntegras se observa una banda única de ADN en la parte superior del gel, si se degrada aparecerá smear a lo largo de la calle
Comprobación de la pureza de los ácidos nucleicos
Coeficiente entre las absorbancias a 260 nm y 280 nm (resultados entre 1,7 y 2 para ADN y 1,8 y 2,1 para ARN). Para evitar contaminación por proteínas
Coeficiente entre las adsorbancias a 260 nm y 230 nm (entre 1,5 y 2,2). Para evitar la contaminación por carbohidratos y sales
Comprobación de la concentración de ácidos nucleicos
Absorbancia de 260 nm y la fluorescencia
