Tema 3 - Extracción y purificación de los ácidos nucleicos

Question 1

Necesidad de pretratar las muestras biológicas

Answer 1

Buscamos obtener suspensiones celulares que están formadas por células libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de un medio líquido

Question 2

Muestras de sangre para extracción de ADN

Answer 2

Partimos de una muestra de sangre anticoagulada con EDTA, heparina o citrato sódico

Question 3

Pretratamiento de la sangre

Answer 3

1. Lisis de los hematíes
2. Centrifugado de la muestra
3. Eliminación del sobrenadante (componentes del plasma y la hemoglobina)
4. Conservación del sedimento (leucocitos)

Question 4

Obtención de células mononucleadas de sangre periférica

Answer 4

1. Se coloca en el tubo un medio de separación (con polisucrosa que agrege los hematíes) y encima la sangre
2. Centrifugado de la muestra
3. Se elimina el plasma sobrenadante y se aspira la capa de células mononucleadas, por debajo quedan el medio de separación y los granulocitos y hematíes agregados
4. Se lavan las células mononucleadas con tampón o solución salina para eliminar restos de plasma y plaquetas y se continua con el proceso

Question 5

Pretratamiento de cultivos celulares en suspensión

Answer 5

1. Se recolecta el tubo
2. Se elimina el medio de cultivo mediante centrifugación
3. Se lavan las células con tampón o suero fisiológico

Question 6

Pretratamiento de cultivos celulares en monocapa

Answer 6

• Utilizando el propio frasco
  1. Retirar el frasco del medio de cultivo
  2. Lavar la monocapa con tampón o solución salina
  3. Iniciar in situ el proceso de extracción
• Pasando la monocapa a un tubo
  1. Despegamos la monocapa de células de la pared del frasco con un raspador o una solución de tripsina
  2. Recolectamos las células en un tubo
  3. Lavamos las células antes de continuar con la extracción

Question 7

Pretratamiento en tejidos animales o vegetales frescos

Answer 7

Consiste en la homogeneización, el tratamiento al que se somete el tejido para liberar las células que lo integran

Question 8

Homogeneización mecánica

Answer 8

• Homogeneización mecánica automatizada
  1. Se corte en pequeños fragmentos el tejido y se homogeneiza por medio de trituradores, agentes abrasivos, sonicadores….
  2. Se transfiere a un tubo limpio para iniciar la extracción
• Homogeneización mecánica manual con mortero:
  1. Se cubren los fragmentos de tejido con N2 líquido
  2. Se pulverizan los fragmentos con ayuda del mortero hasta conseguir un polvo fino y se deja evaporar el N2
  3. El polvo se transfiere a un tubo para comenzar la extracción

Question 9

Homogeneización química

Answer 9

1. Se añade la muestra a la mezcla de incubación que contiene las proteasas y detergentes para la digestión del tejido
2. Se lleva la muestra a la incubadora, pasado el tiempo de incubación se retira y se sigue con la extracción

Question 10

Pretratamiento de tejidos en formol e incluidos en parafina

Answer 10

1. Se obtienen cortes finos de 5-10 micras
2. Se transfieren unos 5-10 cortes a un tubo eppendorf
3. Se incuba secuencialmente con xilol u otro agente desparafinante, etanoles de concentración decreciente (100-96-70 %) y agua destilada
4. El tejido desparafinado y rehidratado se somete a una homogeneización química

Question 11

Pretratamientos de cultivos de bacterias y levaduras

Answer 11

• En medio líquido
  1. Se centrifuga el tubo para eliminar el medio de cultivo sobrenadante
  2. El sedimento se resuspende en el tampón de suspensión
• En medio sólido
  1. Se recoge una colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril
  2. Se resuspende la colonia en el tapón de suspensión

Question 12

Pretratamiento de células de la mucosa oral

Answer 12

• Mediante raspado con torunda o cepillo
• Mediante enjuage con una solución conservante (NaCl 0,9%(
• Recolectando directamente la saliva

Question 13

Pretratamiento de muestras de esputo

Answer 13

Fluidificación con un agente mucolítico del tipo NALC en una disolución de citrato sódico. Si el microorganismo que se quiere detectar es una microbacteria se puede aádir hidróxido sódico como descontaminante.

Question 14

Solución de lisis para la extracción de ácidos nucleicos

Answer 14

Detergentes: desestructuran la bicapa lipídica y desnaturalizan las proteínas que se insertan en ellas efectuando la lisis celular (SDS en animales)

EDTA: agente quelante que al atrapar los cationes de Mg inhibe la actividad de las ADNasas

Proteasas: como la proteinasa K que digiere las proteínas membranales facilitando la rotura de tales estructuras y elimina las nucleasas

Agentes caotrópicos: modifican las interacciones intramoleculares no covalentes. Isotiocianato de guanidinio, un potente inactivador de ARNasas

Question 15

Tratamientos adicionales en células con pared celular

Answer 15

Tratamiento enzimático: lisozima (degrada la pared de bacterias gram positivas) y liticasa (para células vegetales, levaduras y hongos)

Tratamiento mecánico: es posible causar en bacterias la ruptura de la pared con medios tales como ebullición, ciclos de congelación, sonicación…

Tratamiento con CTAB: detergente más potente que el SDS para células con alto contenido de polisacáridos y polifenoles que puedan interferir

Question 16

Consideraciones en la extracción del ADN

Answer 16

Es posible purificar exclusivamente ADN añadiendo al medio de reación ARNasa A. No es necesario en muetras de sangre periférica o médula

Question 17

Purificación con solventes orgánicos

Answer 17

1. Eliminación de los compuestos solubles en solventes orgánicos (fenol, cloroformo y alcohol isoamílico). Se centrifuga y quedan un sobrenadante acuoso (ácidos nucleicos, sales minerales y componentes hidrosolubles) y una fase orgánica (proteínas y lípidos)
2. Precipitación del ADN: se transfiere la fase acuosa a un tubo limpio y se precipita el ADN añadiendo acetato sódico y etanol al 100%, se centrifuga y el sobrenadante con todos los contaminantes hidrosolubles es eliminado
3. Lavado del ADN: se lava con alcohol 70% y se vuelve a centrifugar, el ADN queda como sedimento y los restos de sales y posibles contaminantes solubles en etanol se eliminan con el sobrenadante
4. Resuspensión del ADN: se eliminan los restos de etanol y se resuspende con agua destilada o tampón tris-EDTA

Question 18

Purificación mediante precipitación con sales

Answer 18

1. Precipitación de proteínas: se añade al lisado una solución salina concentrada que precipita las proteínas y se centrifuga
2. Precipitación del ADN: el sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y se añade etanol para provocar la precipitación del ADN, volvemos a centrifugar
3. Lavado y resuspensión del ADN: se elimina el sobrenadante y el ADN se lava con etanol 70% y se resuspende en agua destilada o tampón TE

Question 19

Purificación mediante cromatografía de adsorción

Answer 19

Utilizamos columnas de polipropileno en cuyo interior colocamos membranas de lana de vidrio o perlas de sílice conectadas a un tubo colector.

Al centrifugar se adhieren los ácidos nucleicos a las membranas, añadimos etanol 70% para lavar el resto de contaminantes

Question 20

Purificación mediante esferas magnéticas

Answer 20

1. Microesferas magnéticas se recubren con grupos funcionales con alta afinidad con el ADN
2. Al aplicar un campo magnético estas esferas se ven atraídas arrastrando con ellas el material genético que buscamos

Question 21

Ultrafiltración

Answer 21

1. La muestra (generalmente mezcla de reacción de PCR) se carga directamente en la columna y se centrifuga de manera que al tubo colector pasan solo los contaminantes
2. El filtro se lava con etanol 70% para eliminar restos de contaminantes
3. Añadimos a la columna agua destilada o tampón TE para resuspender los productos de PCR

Question 22

Cromatografía de intercambio iónico

Answer 22

Se basa en la unión electroestática reversible de los iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria

Question 23

Tratamiento del agua para estos procesos

Answer 23

Debeos utilizar exclusivamente agua destilada tratada con dietilpirocarbotano (DEPC) al 0,1% que la libra de ARNasas (método estándar)

Question 24

Comprobación de la integridad de los ácidos nucleicos

Answer 24

Realizamos electroforesis en gel de agarosa, en las muestras íntegras se observa una banda única de ADN en la parte superior del gel, si se degrada aparecerá smear a lo largo de la calle

Question 25

Comprobación de la pureza de los ácidos nucleicos

Answer 25

Coeficiente entre las absorbancias a 260 nm y 280 nm (resultados entre 1,7 y 2 para ADN y 1,8 y 2,1 para ARN). Para evitar contaminación por proteínas

Coeficiente entre las adsorbancias a 260 nm y 230 nm (entre 1,5 y 2,2). Para evitar la contaminación por carbohidratos y sales

Question 26

Comprobación de la concentración de ácidos nucleicos

Answer 26

Absorbancia de 260 nm y la fluorescencia