Tema 4 - Hibridación de los ácidos nucleicos Flashcards
Hibridación (definición)
Unión de dos cadenas monocatenarias de ácidos nucleicos, por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria
Hibridación (aplicaciones)
- Estudios de expresión génica
- Deteccción de secuencias extrañas en muestras biológicas (virus, bacterias y parásitos)
- Control de calidad de PCR para comprobar la especificidad de los productos amplificados
Secuencia diana (definición)
Secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema
Sonda (definición)
Cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana
Desnaturalización (definición)
Propiedad del ADN consistente en la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de H entre las bases nitrogenadas complementarias
Curva de fusión del ADN (concepto)
Si se mide la absorbancia a 260 nm de una solución de una molécula bicatenaria de ADN en función de la temperatura se obtiene una curva, sigmoide en procariotas y escalonada en eucariotas
Zonas de la curva sigmoide de fusión del ADN
- Zona A: valor cte de la absorbancia de 260 nm, no se cumplen las condiciones necesarias para la ruptura de los puentes de H
- Zona B: aumento de la absorbancia de 260 nm (efecto hipercrómico) lo cual indica una paulatina desnaturalización del ADN. En esta zona aparece el concepto de Tm
- Zona C: la absorbancia alcanza su máximo valor y permanece cte, se ha producido la desnaturalización completa de la molécula
Tm (definición)
Temperatura a la cual la absorbancia a 260 nm del ADN alcanza su valor medio e indica el punto en el cual el ADN se encuentra desnaturalizado a la mitad
Variaciones de la Tm según el tamaño de la molécula
- Para moléculas pequeñas (<500pb): aumenta con la longitud
- Para moléculas grandes (>500 pb): aumenta con %GC
Renaturalización (definición)
Proceso por el cual las cadenas de una molécula de ADN completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a asociarse, al bajar lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original.
Factores que influyen en la velocidad de renaturalización
- Cuanto mayor sea la concentración, mayor será la probabilidad de que dos cadenas complementarias se encuentren y por lo tanto, será mayor la velocidad de renaturalización
- Por el mismo motivo, la velocidad de renaturalización es inversamente proporcional a la complejidad de la molécula
Curva de renaturalización (definición)
Representación de la fracción de ADN renaturalizado (%) frente al logaritmo C0t
Curva de renaturalización en procariotas
Para grandes moléculas y genomas sin secuencias repetidas es una curva sigmoide en la que es posible definir un punto medio C0t1/2
Curva de renaturalización en eucariotas
En el caso de grandes moléculas y genomas con secuencias repetidas la curva es escalonada con varios puntos de inflexión correspondientes a: secuencias altamente repetidas (componente rápido), secuencias moderadamente repetidas (componente intermedio) y secuencias únicas (componente lento)
Cálculo de la complejidad de un genoma
Se mide en pb contando una única vez cada secuencia repetida y sumando su valor al de las secuencias únicas
Factores que influyen en la desnaturalización
- Fuerza iónica de la solución: la adición de cationes monovalentes a la disolución neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos del ADN aumentando la Tm.
- Presencia de agentes desnaturalizantes: la adición de sustancias tales como dimetilsulfóxido (DMSO) y la formamida desestabilizan los puentes de H reduciendo la Tm
- Porcentaje de bases no complementarias (mismatch): una proporción superior de bases desapareadas aún cuando la hibridación sea positiva disminuye la Tm
Características generales de las sondas
- Pueden ser monocatenarias o bicatenarias
- Especificidad: es la capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se va a unir. Para considerarse específica debe de tener al menos 16 bases
- Sensibilidad: es un parámetro relacionado con la capacidad que tiene la sonda para aceptar marcadores lo que facilita su estudio
Sondas de ADN (síntesis química)
Se obtienen mediante condensación química secuencial de los desoxirribonucleótidos concretos que interesa incorporar para conseguir una secuencia determinada
- Ventajas: al ser monocatenarias no requieren desnaturalización por calor durante el proceso de hibridación y su tamaño reducido les permite una mejor penetración del tejido
- Inconvenientes: baja sensibilidad y baja especificidad debido a su pequeño tamaño
Sondas de ADN (de ADN recombinante)
Obtenidas mediante clonación de ADN empleando moléculas vectores
- Ventajas: gran tamaño y por lo tanto elevada especificidad y sensibilidad
- Desventajas: bicatenarias y por lo tanto necesitan de desnaturalización previa antes de ser utilizadas
Sondas de ADN (PCR)
Se obtiene el fragmento que nos interesa como sonda mediante PCR, implica conocer las secuencias que flanquean al fragmento que queremos amplificar
- Bicatenarias y de tamaño intermedio
Sondas de ARN
Conocidas también como ribosondas, son menos utilizadas que las de ADN. Son muy sensibles a la acción de ARNasas y siempre son monocatenarias, se obtienen mediante síntesis química como su análogo ADN
PNA
Sondas de ácidos nucleicos peptídicos: la hibridación se produce entre la secuencia diana y una sonda que posee bases nitrogenadas metiladas unidas a un esqueleto de aminoetil-glicina sin ribosas ni grupos fosfato. Suelen emplearse principalmente en técnicas de hibridación in situ.
- No presentan carga negativa al carecer de grupos fosfato
- No son degradadas por nucleasas ni proteasas lo que les confiere gran estabilidad
- Hibridan con mayor velocidad que sus contrapartidas de ADN o ARN
- Son muy específicas
- Su solubilidad es mucho menor que sus contrapartidas de ADN o ARN
- Solo se pueden obtener mediante síntesis química
LNA
Sondas de ácidos nucleicos bloqueados: presentan mayor sensibilidad y especificidad que su contrapartida sin modificar, son de pequeño tamaño y son principalmente empleadas en técnicas de hibridación in situ.
Metodos de marcaje de sondas
- Fluorocromos
- Isótopos radiactivos
- Haptenos
Marcaje de sondas mediante fluorocromos
Son componentes que emiten luz al ser excitados por UV, tradicionalmente se han utilizado derivados de la fluoresceína y la rodamina pero actualmente se han desarrollado otros como las cianinas y la familia Alexa-flúor. Se utilizan principalmente en las técnicas de hibridación in situ (FISH)
Marcaje de sondas mediante isótopos radiactivos
Los más utilizados son el 32P y el tritio, se realiza introduciendo nucleótidos radiactivos que contienen alguno de estos isótopos. Se consigue una gran sensibilidad pero requiere de una infraestructuras adecuadas para el manejo de material radiactivo, la detección del híbrido se realiza revelando el marcaje radiactivo mediante autorradiografía con una película de rayos X
Marcaje de sondas mediante haptenos
Los más utilizados son la digoxigenina y la biotina, la detección del híbrido requiere métodos indirectos de revelado que se basan en la afinidad química de moléculas o en métodos inmunológicos
Desplazamiento de mella o Nick translation
- Sirve para marcar sondas de ADN bicatenario de gran tamaño obtenidas por técnicas de ADN recombinante o genomas completos
- Se emplean isótopos radiactivos o haptenos
Incubamos la sonda bicatenaria a baja temperatura (15ºC) añadiendo ADN polimerasa, ADNasa I y una mezcla de dNTPs
La ADNasa I rompe enlaces fosfodiéster entre nucleótidos al azar, estas roturas se denominan mellas
La ADN polimerasa induce la elongación y mediante su actividad exonucleasa corrige y repara los errores eliminando los desoxirribonucleótidos entre mellas colocando los dNTPs que servirán como marcadores
Cebado al azar o aleatorio (random priming)
- Sirve para marcar sondas bicatenarias de gran tamaño o genomas completos
- Se emplean isótopos radiactivos o haptenos
Incubamos la sonda añadiendo fragmentos Klenow (ADN polimerasa I que elonga en dirección 5´- 3´ sin actividad exonucleasa), dNTPs (1 de ellos marcado) y una mezcla de hexámeros constituida por todas las combinaciones posibles de nucleótidos
Desnaturalizamos la sonda e inducimos las condiciones adecuadas para que esta hibride con los hexámeros
Llega la ADN polimerasa I (Klenow) y sintetiza cadenas complementarias incorporando dNTPs que hay en el medio de reacción rellenando los huecos donde no hay hexámeros
Marcaje terminal
- Sirve para marcar sondas de ADN bicatenario o monocatenario de pequeño y mediano tamaño
- Se emplean fluorocromos o haptenos
Introducimos Tdt que actúa como una ADN polimerasa que no necesita cebador ni cadena molde para ir sintetizando y dNTPs o ddNTPs (1 de ellos marcado)
Se pueden producir dos tipos de marcaje: marcaje único en el extremo 3¨ (si la Tdt emplea un ddNTPs) o incorporación de una cola de nucleótidos marcados
Purificación de la sonda marcada (definición)
Proceso que consiste en la eliminación de los nucleótidos libres marcados para evitar ruido de fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación
Fases de la hibridación
- Fase de prehibridación
- Fase de hibridación
- Lavado de poshibridación
- Fase de detección del híbrido
Temperatura óptima para la fase de hibridación
Entre Tm-32ºC y Tm-16ºC, óptima Tm-25ºC
Condiciones idóneas para la fase de hibridación
Baja concentración de agentes desnaturalizantes y alta concentración de cationes monovalentes
Condiciones relajadas y estrictas en el lavado de poshibridación
Relajadas (alta concentración salina y baja concentración de agentes desnaturalizantes)
Estricta (baja concentración salina, alta concentración de agentes desnaturalizantes y temperaturas elevadas)
