Tema 4 - Hibridación de los ácidos nucleicos

Question 1

Hibridación (definición)

Answer 1

Unión de dos cadenas monocatenarias de ácidos nucleicos, por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria

Question 2

Hibridación (aplicaciones)

Answer 2

• Estudios de expresión génica
• Deteccción de secuencias extrañas en muestras biológicas (virus, bacterias y parásitos)
• Control de calidad de PCR para comprobar la especificidad de los productos amplificados

Question 3

Secuencia diana (definición)

Answer 3

Secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema

Question 4

Sonda (definición)

Answer 4

Cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana

Question 5

Desnaturalización (definición)

Answer 5

Propiedad del ADN consistente en la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de H entre las bases nitrogenadas complementarias

Question 6

Curva de fusión del ADN (concepto)

Answer 6

Si se mide la absorbancia a 260 nm de una solución de una molécula bicatenaria de ADN en función de la temperatura se obtiene una curva, sigmoide en procariotas y escalonada en eucariotas

Question 7

Zonas de la curva sigmoide de fusión del ADN

Answer 7

• Zona A: valor cte de la absorbancia de 260 nm, no se cumplen las condiciones necesarias para la ruptura de los puentes de H
• Zona B: aumento de la absorbancia de 260 nm (efecto hipercrómico) lo cual indica una paulatina desnaturalización del ADN. En esta zona aparece el concepto de Tm
• Zona C: la absorbancia alcanza su máximo valor y permanece cte, se ha producido la desnaturalización completa de la molécula

Question 8

Tm (definición)

Answer 8

Temperatura a la cual la absorbancia a 260 nm del ADN alcanza su valor medio e indica el punto en el cual el ADN se encuentra desnaturalizado a la mitad

Question 9

Variaciones de la Tm según el tamaño de la molécula

Answer 9

• Para moléculas pequeñas (<500pb): aumenta con la longitud

- Para moléculas grandes (>500 pb): aumenta con %GC

Question 10

Renaturalización (definición)

Answer 10

Proceso por el cual las cadenas de una molécula de ADN completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a asociarse, al bajar lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original.

Question 11

Factores que influyen en la velocidad de renaturalización

Answer 11

• Cuanto mayor sea la concentración, mayor será la probabilidad de que dos cadenas complementarias se encuentren y por lo tanto, será mayor la velocidad de renaturalización
• Por el mismo motivo, la velocidad de renaturalización es inversamente proporcional a la complejidad de la molécula

Question 12

Curva de renaturalización (definición)

Answer 12

Representación de la fracción de ADN renaturalizado (%) frente al logaritmo C0t

Question 13

Curva de renaturalización en procariotas

Answer 13

Para grandes moléculas y genomas sin secuencias repetidas es una curva sigmoide en la que es posible definir un punto medio C0t1/2

Question 14

Curva de renaturalización en eucariotas

Answer 14

En el caso de grandes moléculas y genomas con secuencias repetidas la curva es escalonada con varios puntos de inflexión correspondientes a: secuencias altamente repetidas (componente rápido), secuencias moderadamente repetidas (componente intermedio) y secuencias únicas (componente lento)

Question 15

Cálculo de la complejidad de un genoma

Answer 15

Se mide en pb contando una única vez cada secuencia repetida y sumando su valor al de las secuencias únicas

Question 16

Factores que influyen en la desnaturalización

Answer 16

• Fuerza iónica de la solución: la adición de cationes monovalentes a la disolución neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos del ADN aumentando la Tm.
• Presencia de agentes desnaturalizantes: la adición de sustancias tales como dimetilsulfóxido (DMSO) y la formamida desestabilizan los puentes de H reduciendo la Tm
• Porcentaje de bases no complementarias (mismatch): una proporción superior de bases desapareadas aún cuando la hibridación sea positiva disminuye la Tm

Question 17

Características generales de las sondas

Answer 17

• Pueden ser monocatenarias o bicatenarias
• Especificidad: es la capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se va a unir. Para considerarse específica debe de tener al menos 16 bases
• Sensibilidad: es un parámetro relacionado con la capacidad que tiene la sonda para aceptar marcadores lo que facilita su estudio

Question 18

Sondas de ADN (síntesis química)

Answer 18

Se obtienen mediante condensación química secuencial de los desoxirribonucleótidos concretos que interesa incorporar para conseguir una secuencia determinada

• Ventajas: al ser monocatenarias no requieren desnaturalización por calor durante el proceso de hibridación y su tamaño reducido les permite una mejor penetración del tejido
• Inconvenientes: baja sensibilidad y baja especificidad debido a su pequeño tamaño

Question 19

Sondas de ADN (de ADN recombinante)

Answer 19

Obtenidas mediante clonación de ADN empleando moléculas vectores

• Ventajas: gran tamaño y por lo tanto elevada especificidad y sensibilidad
• Desventajas: bicatenarias y por lo tanto necesitan de desnaturalización previa antes de ser utilizadas

Question 20

Sondas de ADN (PCR)

Answer 20

Se obtiene el fragmento que nos interesa como sonda mediante PCR, implica conocer las secuencias que flanquean al fragmento que queremos amplificar

• Bicatenarias y de tamaño intermedio

Question 21

Sondas de ARN

Answer 21

Conocidas también como ribosondas, son menos utilizadas que las de ADN. Son muy sensibles a la acción de ARNasas y siempre son monocatenarias, se obtienen mediante síntesis química como su análogo ADN

Question 22

PNA

Answer 22

Sondas de ácidos nucleicos peptídicos: la hibridación se produce entre la secuencia diana y una sonda que posee bases nitrogenadas metiladas unidas a un esqueleto de aminoetil-glicina sin ribosas ni grupos fosfato. Suelen emplearse principalmente en técnicas de hibridación in situ.

• No presentan carga negativa al carecer de grupos fosfato
• No son degradadas por nucleasas ni proteasas lo que les confiere gran estabilidad
• Hibridan con mayor velocidad que sus contrapartidas de ADN o ARN
• Son muy específicas
• Su solubilidad es mucho menor que sus contrapartidas de ADN o ARN
• Solo se pueden obtener mediante síntesis química

Question 23

LNA

Answer 23

Sondas de ácidos nucleicos bloqueados: presentan mayor sensibilidad y especificidad que su contrapartida sin modificar, son de pequeño tamaño y son principalmente empleadas en técnicas de hibridación in situ.

Question 24

Metodos de marcaje de sondas

Answer 24

• Fluorocromos
• Isótopos radiactivos
• Haptenos

Question 25

Marcaje de sondas mediante fluorocromos

Answer 25

Son componentes que emiten luz al ser excitados por UV, tradicionalmente se han utilizado derivados de la fluoresceína y la rodamina pero actualmente se han desarrollado otros como las cianinas y la familia Alexa-flúor. Se utilizan principalmente en las técnicas de hibridación in situ (FISH)

Question 26

Marcaje de sondas mediante isótopos radiactivos

Answer 26

Los más utilizados son el 32P y el tritio, se realiza introduciendo nucleótidos radiactivos que contienen alguno de estos isótopos. Se consigue una gran sensibilidad pero requiere de una infraestructuras adecuadas para el manejo de material radiactivo, la detección del híbrido se realiza revelando el marcaje radiactivo mediante autorradiografía con una película de rayos X

Question 27

Marcaje de sondas mediante haptenos

Answer 27

Los más utilizados son la digoxigenina y la biotina, la detección del híbrido requiere métodos indirectos de revelado que se basan en la afinidad química de moléculas o en métodos inmunológicos

Question 28

Desplazamiento de mella o Nick translation

Answer 28

• Sirve para marcar sondas de ADN bicatenario de gran tamaño obtenidas por técnicas de ADN recombinante o genomas completos
• Se emplean isótopos radiactivos o haptenos

Incubamos la sonda bicatenaria a baja temperatura (15ºC) añadiendo ADN polimerasa, ADNasa I y una mezcla de dNTPs

La ADNasa I rompe enlaces fosfodiéster entre nucleótidos al azar, estas roturas se denominan mellas

La ADN polimerasa induce la elongación y mediante su actividad exonucleasa corrige y repara los errores eliminando los desoxirribonucleótidos entre mellas colocando los dNTPs que servirán como marcadores

Question 29

Cebado al azar o aleatorio (random priming)

Answer 29

• Sirve para marcar sondas bicatenarias de gran tamaño o genomas completos
• Se emplean isótopos radiactivos o haptenos

Incubamos la sonda añadiendo fragmentos Klenow (ADN polimerasa I que elonga en dirección 5´- 3´ sin actividad exonucleasa), dNTPs (1 de ellos marcado) y una mezcla de hexámeros constituida por todas las combinaciones posibles de nucleótidos

Desnaturalizamos la sonda e inducimos las condiciones adecuadas para que esta hibride con los hexámeros

Llega la ADN polimerasa I (Klenow) y sintetiza cadenas complementarias incorporando dNTPs que hay en el medio de reacción rellenando los huecos donde no hay hexámeros

Question 30

Marcaje terminal

Answer 30

• Sirve para marcar sondas de ADN bicatenario o monocatenario de pequeño y mediano tamaño
• Se emplean fluorocromos o haptenos

Introducimos Tdt que actúa como una ADN polimerasa que no necesita cebador ni cadena molde para ir sintetizando y dNTPs o ddNTPs (1 de ellos marcado)

Se pueden producir dos tipos de marcaje: marcaje único en el extremo 3¨ (si la Tdt emplea un ddNTPs) o incorporación de una cola de nucleótidos marcados

Question 31

Purificación de la sonda marcada (definición)

Answer 31

Proceso que consiste en la eliminación de los nucleótidos libres marcados para evitar ruido de fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación

Question 32

Fases de la hibridación

Answer 32

1. Fase de prehibridación
2. Fase de hibridación
3. Lavado de poshibridación
4. Fase de detección del híbrido

Question 33

Temperatura óptima para la fase de hibridación

Answer 33

Entre Tm-32ºC y Tm-16ºC, óptima Tm-25ºC

Question 34

Condiciones idóneas para la fase de hibridación

Answer 34

Baja concentración de agentes desnaturalizantes y alta concentración de cationes monovalentes

Question 35

Condiciones relajadas y estrictas en el lavado de poshibridación

Answer 35

Relajadas (alta concentración salina y baja concentración de agentes desnaturalizantes)
Estricta (baja concentración salina, alta concentración de agentes desnaturalizantes y temperaturas elevadas)