Técnicas mais usadas no estudo de vírus Flashcards
Qual o uso de sistemas animais hospedeiros na virologia?
- Produzir vírus que não conseguem ser estudados eficientemente in vitro;
- Estudar a patogênese de infeções virais
- Estudar a segurança de vacinas
Ovos embrionados podem ser usados para:
Reproduzir vírus e criar vacinas
Dificuldades em estudar vírus:
- Criação e manutenção de animais infetados com vírus patogénicos é caro;
- Animais são sistemas complexos e pode ser difícil de isolar os efeitos do vírus
- Resultados obtidos nem sempre são reproduzíveis, dado a variações entre hospedeiros
- Uso de animais experimental é moralmente inaceitável
É preferível estudar vírus em ____________ do que em sistemas animais porque é mais fáceis, rápidas e baratas.
Cultura de células
Como se induz a imortalização das células em cultura?
Transfecção e sobreexpressão de antigénio T
O método de placas mede …?
A quantidade de viriões viáveis (que causam a morte celular.
Qual a técnica no método de placas?
Diluições sucessivas em serie da amostra inicial para quantificar o vírus → Amostra inicial (diluída) colocada sobre uma camada de células durante 1h para aderirem às células → colocar um meio semissólido para restringir o movimento das novas partículas viriais (só poderão infetar células vizinhas) → morte de células localizada que formam uma placa
- contagem de placas entre 10 a 100
Para vírus que não induzem a morte celular deve-se usar o método:
Focos Fluorescentes
Descrever a técnica de focos fluorescentes:
Similar ao método de placas, mas depois da absorção e expressão génica, as células são permeabilizadas → adicionam-se anticorpos contra uma proteína viral → células são visualizadas num microscópio a um comprimento de onda adequado → o título do vírus é expresso em unidades formadas de focos fluorescentes por mililitro
O método infectious-center é utilizado para:
Determinar a fração de células numa cultura que estão infetadas com o vírus
Descrição do método infectious-center:
Suspende-se uma monocamada de células infetadas antes de serem gerada novas partículas virais → diluição conhecida de células infetadas é depois plaqueada numa monocamada de células suscetíveis a infeção → observa-se o número de placas que se forma → número de placas será equivalente ao número de células infetadas na amostra original (tendo em conta o fator de diluição)
O método end-point diluition é usada:
Para vírus que não formem placas ou para determinar a virulência de vírus em animais
Técnica do método de end-point dilution assay:
São preparadas várias diluições de vírus → sujeitam-se culturas de células a essas diluições → observam-se os efeitos citopáticos → encontra-se a diluição em que 50% das culturas foram infetadas (end-point dilution)
Como se pode determinar a quantidade de vírus através das microscopia eletrónica?
Mistura-se a amostra de vírus com uma amostra de latex beads de concentração conhecida → contam-se os números de partículas virais e de latex beads → determinação da concentração do vírus por comparação.
Em que consiste a técnica de live-cell imaging of single fluorescent virions?
É inserido um gene de uma proteína fluorescente no genoma viral, e normalmente funde-se com o código genético de uma partícula viral → a proteína de fusão é incorporada na partícula viral → visível por microscopia de fluorescência
Em que se baseia a hemaglutinação?
Vírus podem conter proteínas que se ligam a eritrócitos, sendo que um vírus se pode ligar a mais que uma célula, formando agregados
O teste baseado na hemaglutinação é __________-, mas não é __________.
Rápido
Sensível (não deteta pequenas quantidades do vírus)
Exemplo de vírus em que se pode usar a técnica de hemaglutinação.
Influenza → contém uma glicoproteína no envelope, hemaglutinina que se liga a glicoproteínas nos eritrócitos
Como é que se pode medir a atividade enzimática de um vírus?
Misturando partículas permeáveis com percursores marcados radioativamente
Ex: averiguar a presença de transcriptase reversa
→ misturar uma cultura de células com detergente para permeabilizar o envelope viral → adicionar um template de RNA, primers e nucleótidos radioativos → se a transcriptase reversa estiver presente, vais se formar um produto que se pode precipitado e quantidificado
A técnica da imunofluorescência permite:
→ Determinar a sublocalização de partículas virais particulares (ex: núcleo, citoplasma)
→ Identificar células infetadas em populações de células ou num tecido
Técnicas para detetarácidos nucleicos virais:
→ PCR
→ High-trhroughout sequencing
→ DNA microarrays
Diferença entre PCR convencional e em tempo real:
Convencional - no final da reação, DNA é marcado e depois separado e observado
Em tempo real: durante a própria reação, através da utilização de fluoróforos específicos para DNA é possível analisar a quantidade produzida de DNA
Locais apropriados em ovos embrionados para replicação viral:
Cavidade amniótica
Saco vitelino
Cavidade alantoica
Membrana corioalantoica
