Técnicas de DNA recombinante e Aplicações Flashcards
O que é a clonagem?
A clonagem é um processo em que se insere um gene num vetor (fago ou plasmídeo) e este é inserido num hospedeiro e vai, então, passar a produzir grandes quantidades deste gene.
O diagnóstico da distrofia Muscular de Duchenne pode ser feito por mapa de exões ou por PCR múltiplo. Escolha uma destas opções e diga quais as etapas requeridas para executar a técnica escolhida e como pode validar o resultado obtido para indicar se está ou não na presença de um portador desta doença.
A distrofia Muscular de Duchenne é uma doença recessiva associada ao cromossoma X, resultante de deleções e duplicações de exões, no gene que codifica a distrofina. Neste caso seria mais viável recorrer ao mapa de exões uma vez que apenas iremos analisar a posição/deleção do exão onde se encontra o codão que codifica a distrofina. O método de PCR baseia-se no processo de replicação do DNA de forma a obter cadeiras maiores, enquanto que o mapa de exões se elabora de modo a detetar os exões que foram duplicados e/ou eliminados.
Diga as características dos vetores de clonagem e dos de expressão.
Vetores de clonagem:
-Os vetores de clonagem permitem a clonagem. Estes têm que possuir locais de restrição única, capacidade de “hospedar” e “transportar” fragmentos de DNA estranho, têm que ser purificados, ter pelo menos 1 gene que contenha resistência a antibióticos e além disso, estes têm que ser capazes de se autoreplicar.
Vetores de expressão:
-Os vetores de expressão são vetores que possuem um gene que é facilmente transcrito e traduzido pela célula hospedeira. Estes têm de ter um local de origem de replicação, um promotor, um codão de iniciação seguido de um plylinker, local de ligação ao ribossoma, têm que ser fáceis de purificar e ter pelo menos um gene que contenha resistência a 1 antibiótico.
O que é uma biblioteca de genes?
Uma biblioteca de genes é uma coleção de fragmentos de DNA, obtidos a partir da digestão de um DNA com enzimas de restrição que foram ligados a vetores e clonados num hospedeiro. Sendo que podem ser genómicas, de cDNA ou de expressão.
Primeiramente, faz-se o isolamento do DNA e quebra-se com ER. De seguida, inserimos no vetor e posteriormente na célula recetora, permitindo a clonagem para obtermos uma coleção de fragmentos de DNA de uma espécie.
Distingue Southern Blot, de Nothern Blot e Western Blot.
Southern Blot:
-Permite analisar sequências de DNA específicas e ver, estruturalmente, os genes
-Deteta mutações pontuais
-Permite fazer o mapa físico de locais de restrição de um gene
Nothern Blot:
-Permite verificar a presença de mRNAs específicos e até quantificá-los
-Deteta o tamanho do RNA e se ele está degradado ou não
Western Blot:
-Permite selecionar proteínas específicas
O que acontece na eletroforese em gel, quando temos grande concentração de agarose?
Quanto maior a concentração de agarose, menor são os poros e, por isso, ficam retidas proteínas de maior dimensão.
O que é a transformação?
A transformação é um mecanismo no qual o DNA recombinante pode ou não ser integrado no genoma da bactéria após choque térmico. Neste processo são necessárias células competentes, previamente tratadas com CaCl2 em gelo e um choque térmico.
Diferença entre ratinhos knock-in e knock-out.
Os ratinhos knock-in são ratinhos trangénicos em que ocorre a modificação de um gene ou a inserção de um novo.
Enquanto que os ratinhos knock-out são ratinhos trangénicos em que ocorre a alteração de um gene que o inativa ou o elimina.
Como saber que obtivemos ratinhos trangénicos?
Podemos usar 2 marcadores: a TK (cinase da timina) e a NeoR (resistência à neosina).
O TK é adicionado adjacente ao gene a analisar e o NeoR é adicionado dentro. Para iniciar tem de se obter células que sofreram recombinação homóloga, porque vamos conseguir separá-las. O gene TK torna as células sensíveis ao glacidovir e mata-as, portanto só sobrevivem se houver recombinação homóloga pelo facto de terem incorporado um gene resistente a este antibiótico. O mesmo se passará com as células colocadas em meio com NeoR visto que aquelas que não forem recombinadas não irão sobreviver a um meio com esse composto e as que sofreram recombinação homóloga terão ganho resistência a esse mesmo antibiótico, sobrevivendo.
O que intende por Pulse-Chase?
Pulse-Chase é uma técnica que permite seguir o percurso de uma proteína adicionando aminoácidos radioativos quando esta está a ser sintetizada até atingir o máximo de radioatividade (pulse). Depois retira-se o aminoácido reativo e ocorre o chase.
Qual o princípio base da eletroforese?
A eletroforese é uma técnica que permite a descoberta do tamanho de DNA através da comparação com um DNA padrão. Primeiramente, coloca-se DNA, cortado com enzimas de restrição, no gel e este, com auxílio da corrente elétrica vai migrar e separar-se de acordo com o tamanho. Posteriormente, revela-se com brometo de etídio, por exemplo.
Qual a diferença entre Southern Blot e Nothern Blot?
O Southern Blot analisa o DNA e o Nothern Blot analisa o RNA. Sendo que ao usar o DNA é necessário cortá-lo com enzimas de restrição e com o RNA não, visto que já possui apenas uma cadeia.
Indique o que é uma biblioteca de cDNA.
Uma biblioteca de cDNA é constituída por muitos fragmentos de DNA sem intrões que foram obtidas por uma transcriptase reversa.
Explique a edição do genoma pelo CRISP/Cas9.
Este método é um sistema de defesa adaptativo de bactérias que faz uso de um RNA antisense. Necessita de um RNA guide com o local PAM (local para resolver) e a Cas9 que é utilizada para silenciar genes que possam estar danificados.
Deste modo, a RNA guide (sgRNA) liga-se à nuclease Cas9, este complexo passa pelo DNA até encontrar um local de complementaridade. Há uma mudança conformacional que ativa a nuclease. O DNA de cadeia dupla é clivado e depois reparado pela célula por 2 mecanismos, através das extremidades não homólogas ou recombinação homóloga.
Quais são os tipos de enzimas de restrição?
Tipo I (ATP, SAM, Mg2+): reconhecem uma sequência particular e cortam o DNA num local não específico dessa mesma sequência
Tipo II (Mg2+): reconhecem uma sequência particular e cortam o DNA num local específico dessa mesma sequência
Tipo III (ATP): requerem ATP e clivam a uma distância específica do local de reconhecimento
Tipo IV: clivam a distâncias variáveis do local de reconhecimento e só cortam DNA metilado.
