Técnicas Flashcards
Qual a diferença entre forward e reverse genetics?
-Em Forward genetics induzimos (ou observamos) mutações aleatórias → gera-se mutantes → observamos se surgiu algum fenótipo e se o achamos interessante → associar o fenótipo ao gene mutado para se inferir a função deste gene.
-Em Reverve genetics já temos um gene de interesse → ao fazer uma mutação podemos obter um fenótipo → associar esse fenótipo à função do gene.
Como funciona hibridação in situ (mRNA)?
são usadas sondas de RNA complementares ao RNA de interesse associado a “digoxigenin” → são adicionados anticorpos contra a “digoxigenin” associados a fosfatases → é adicionado um composto sem cor que quando é desfosforilado (pela fosfatase) ganha uma cor roxa → essa cor é detetada.
Como funciona imunohistoquimica (proteínas)?
Usar anticorpos contra a proteína → usar um anticorpo secundário associado a uma fosfatase contra o anticorpo primário → é adicionado um composto transparente que quando é desfosforilado fica roxo → pode ser detetado
Quais as 3 formas gerais de causar loss of function de algum gene?
-Random mutagenesis (forward genetics)
-silenciamento pós-transcripcional (RNAi e morpholino)
-targeted mutagenesis (mutação de um gene de interesse, por exemplo substituindo o gene por outro)
Como funciona loss of function por RNAi?
É fornecido um dsRNA (do gene que queremos silenciar) que é cortado pela enzima Dicer em pequenos fragmentos dsRNA que se separam em ssRNA e que se associam à enzima Argonaute, formando o complexo RISC. Este complexo usa o template de RNA cortado para reconhecer e se ligar ao mRNAs complementares, clivando-os → inibição da tradução
Como funciona loss of function por morpholino?
É uma pequena molécula associado a uma pequena sequência complementar ao mRNA (AUG) impedindo a tradução (bloqueia estérico).
Como funciona gene editing por ZFN e TALEN?
Causam cortes no DNA que quando reparado tem tendência a causar mutações (indel - inserções ou deleções).
Como funciona gene editing por CRISPR?
Usa-se um guide RNA (complementar à sequência de interesse) associado à enzima Cas9. Este complexo é inserido nas células, reconhece e corta a sequência de interesse (nas duas cadeias). A maquinaria da célula quando tenta reparar o corte induz mutações. A sequência alvo precisa estar junto a uma PAM sequence. Este sistema pode ser alterado para em vez de cortar a cadeia, simplesmente se ligar lá, bloqueando a transcrição, ou para introduzir nova sequência.
Como funciona o sistema Cre - LoxP
Um rato tem uma recombinase Cre, mas não tem alvos então não faz nada. Outro rato tem o gene de interesse flanqueado por sequências LoxP e um gene reporter a seguir. Quando se faz o cruzamento o sistema fica completo: a Cre corta o gene de interesse reconhecendo as sequências LoxP e o gene reporter é transcrito. Pode ser adicionado controlo temporal ao usar uma tamoxifen-Cre dependent que só está ativa quando se adiciona tamoxifen.
Como funciona o sistema UAS-Gal4 para controlo espacial e temporal de transcrição?
Neste sistema um mosca WT tem o transgene no qual está codificada GAL4, sobre controlo de um promotor escolhido pelo investigador, com vista a que a expressão de GAL4 ocorra, o que não afeta a mosca, permanecendo WT
Paralelamente, uma outra mosca tem o gene de interesse logo a seguir à sequência UAS (upstream activation sequence), pelo que o gene de interesse só será expresso quando há Gal4 no meio.
Assim, Gal4 funciona como um fator de transcrição para o UAS e, consequentemente, para o gene de interesse, de forma que, ao cruzar as duas moscas, o gene de interesse vai ser expresso apenas nas células onde e quando o promotor escolhido para Gal4 está ativo. Escolhendo um promotor que está ativo apenas num certo tecido, torna possível controlar a expressão do gene de interesse espacialmente
Modelo animal onde é utilizado o sistema Gal4-UAS?
Mosca
Relativamente às aplicações de microscipia, estas podem permitir analisar amostras fixas, como a miscroscopia ____________ e ____________, ou amostras vivas, como a ____________ e ____________.
Amostras fixas: miscroscopia de rastreio e de transmissão
Amostras vivas: microscopia confocal e 2-fotões
Microscopia confocal e 2-fotões associada com GFP:
Estudar a expressão de proteínas ao longo do tempo e em várias células.
- Gal4 sob um promotor escolhido e o gene de interesse está sob o promotor UAS, e ao mesmo tempo, tem a sequência de GFP. O cruzamento destas duas moscas gera descendência que torna possível detetar o gene de interesse pois, quando este for transcrito, GFP também o vai ser e vai emitir fluorescência que é possível de detetar através de microscopia confocal e 2-protões. Por outro lado, também é possível ter apenas o GFP fundido com o gene UAS, sem o gene de interesse, o que permite saber quando e onde ocorre a expressão pelo promotor escolhido para Gal4.
GFPs fotoconvertíveis a RFPs:
GFP foi modificada de forma que, se for atingida por um laser a um comprimento de onda específico, é produzida uma alteração química na proteína que leva à sua conversão para cor vermelha. Este efeito é irreversível, pelo que se pode seguir as células onde ocorreu a conversão ao longo do tempo.
