Technologies de l'ADN Flashcards
Rédigé par Séverine Lemieux Révisé par: Diana
Enzyme clivant les liaisons phosphodiesters entre deux nucléotides
Nucléase
Types de nucléase (2)
Exonucléase
Endonucléase
Nucléase coupant à partir d’une extrémité (5’ vers 3’ ou 3’ vers 5’)
Exonucléase
Nucléase coupant au milieu de la chaîne
Endonucléase
Rôle des enzymes/endonucléases de restriction chez les bactéries
Défense contre les virus en coupant l’ADN étranger
Selon quoi sont nommées les enzymes de restriction?
Selon l’espèce de bactérie de laquelle elles ont été isolées
Séquence reconnue par la majorité des enzymes de restriction
Séquence palindromique
Définir séquence palindromique
Séquence qui se lit de la même façon dans les deux directions
Méthode de séparation des fragments d’ADN
Électrophorèse sur Gel d’Agarose
L’échantillon d’ADN est déposé plus près de la cathode (pôle négatif) ou de l’anode (pôle positif)?
De la cathode (-)
Vrai ou faux.
Les fragments d’ADN plus longs se déplacent plus rapidement vers l’anode (pôle positif)
Faux.
Les plus petits fragments se déplacent plus rapidement.
Pourquoi l’ADN est il attiré par le pôle positif?
Il est chargé négativement.
Molécule de fluorescence s’intercalant à l’intérieur de la double hélice facilicitant l’analyse
Bromure d’Ethidium
Enzyme catalysant la formation d’un nouveau lien phosphodiester
Ligase
Type de fragments d’ADN obtenus suite au clivage par enzymes de restriction (2)
Bouts francs
Bouts collants
L’appariement de quel type de bouts est le plus efficace? Pourquoi?
Bouts collants.
Car les contacts entre deux bouts francs dépendent de collisions aléatoires.
Vrai ou faux.
Il est possible de faire une ligation d’extrémités franches coupés par des enzymes différentes.
Vrai
Définir “cloning”
Insertion d’ADN dans un vecteur d’ADN qui peut se répliquer de façon autonome et illimitée
Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome dans organisme hôte
Plasmide
Composantes du plasmide nécessaires à sa réplication autonome (2)
Origine de réplication
Gène codant pour des protéines de réplication
Séquences d’ADN du plasmide pertinentes au clonage (3)
Origine de réplication
Gène de résistance à un antibiotique
Sites de restriction (de multicolonage)
Rôle du gène de résistance à un antibiotique
Éliminer les bactéries ne contenant pas le vecteur/plasmide
Définir “insert”
Nouveau fragment d’ADN à être cloné
Exemples de protéines recombinantes produites par le clonage d’un fragment d’ADN (5)
Insuline Hormone de croissance (HGH) Facteurs de coagulation Immunogènes (vaccin) Lactase
Processus d’introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou levure
Transformation
Taux d’efficacité de transformation
1/2000 au mieux
Composantes étudiées grâce à Green Fluorescent Protein (GFP) (4)
Niveaux de transcription d’un gène
Niveaux de traduction
Localisation cellulaire de protéine
Co-localisation cellulaire
Origine GFP
Méduse Aequorea victoria
Amorce pour réplication d’ADN in vitro
Oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice synthétisée dans laboratoire
Brin matrice pour réplication d’ADN in vitro
Simple brin synthétique suite à dénaturation thermique d’un brin double
Température à laquelle l’ADN se dénature (devient simple brin)
Entre 85 et 90 degrés
La température de dénaturation est-elle plus élevée ou plus basse pour l’ADN poly A-T? Pour ADN poly G-C?
A-T: plus basse (2 ponts hydrogène)
G-C: plus élevée (3 ponts hydrogène)
Vrai ou faux.
La dénaturation de l’ADN double-brin est irréversible.
Faux. L’ADN se ré-hybride lorsqu’il revient aux bonnes conditions.
Molécule entraînant la terminaison de chaîne
Didéoxyribonucléoside triphosphate (ddNTP)
Pourquoi le ddNTP cause la terminaison de la chaîne
Absence de -OH en 3’
Étapes de la méthode de terminaison de chaîne ou de Sanger (4)
(1) Séparation des brins
(2) Ajout des amorces, des désoxynucléotides (dG, dA, dT, dC), d’un type de didéoxynucléotide (ddNTP) par tube et de l’ADN polymérase
(3) Séparation sur gel et détection des brins synthétisés par extension de l’amorce
(4) Lecture de la séquence sur gel
Types de ddNTP (4)
ddATP
ddTTP
ddCTP
ddGTP
Étapes de la “polymerase-chain reaction” (PCR) (3)
(1) Séparation des brins (95 degrés)
(2) Hybridation des amorces (55 degrés)
(3) Synthèse par l’ADN polymérase
Quelles sont les options d’ADN polymérase pour PCR? (2)
ADN polymérase d’E. coli (37 degrés)
Taql ADN polymérase (72 degrés)
Quel ADN polymérase est privilégié dans la PCR et pourquoi?
Taql ADN Polyérase, car il n’est pas dénaturé par la chaleur (72 degrés)
Nombre de nucléotides dans un short tandem repeat (STR)
2 à 6 nucléotides
Sur quelle particularité des STR et des VNTR se base le DNA fingerprinting?
Le nombre de STR et de VNTR varie dans un même locus pour chaque individu.
Nombre de nucléotides dans un variable number of tandem repeats (VNTR)
10 à 100 nucléotides
Exemples d’utilités des STR et VNRT en médecine légale (3)
Détermination de la paternité
Identification de cadavres
Identification de suspects
Rôle PCR
Amplification d’ADN à partir de très petits échantillons
Qu’est-ce qui représente 90% des variations génétiques humaines?
Polymorphisme de nucléotides simples (SNPs)
Quel pourcentage de l’ADN représente des variations caractérisant chaque individu génétiquement?
0,1%
Nombre approximatif de SNPs dans chaque individu
10 millions (1/300 nucléotide)
Différence entre SNP et mutation
SNP : variation de base d’ADN simple trouvée > 1% de la population
Mutation : variation de base d’ADN simple trouvée <1% de la population
Exemples de traits génétiques associés aux SNPs (5)
La taille et la couleur des yeux et des cheveux
Performance musculaire
Comportement social
Hérédité et susceptibilité à des maladies
Réponse individuelle aux médicaments
SNPs causant un trait génétique, une maladie, une susceptibilité ou une différence de réponse à un traitement
Causatifs (incluent des régions codantes et des régions non-codantes)
SNPs ne causant pas de traits, mais servant de marqueurs de trait
Liés
SNPs pouvant affecter la séquence et la fonction des protéines
Des régions codantes
SNPs pouvant affecter l’épissage de pré- ARNm, la régulation d’un gène, niveau d‘expression
Des régions non-codantes
Bloc caractéristique de plusieurs SNPs pouvant être hérités ensemble
Haplotype
But du projet HapMap
Une carte d’haplotypes identifiés par des SNPs étiquettes :
Réduire le nombre de SNPs requis pour examiner l’ensemble du génome pour l’association avec un phénotype (maladie, sensibilité, etc)
Conséquences bénéfiques du HapMap (3)
Prédire la susceptibilité à des maladies dans une population
Prédire la prédisposition d’un individu à souffrir d’une maladie
Offrir un traitement individualisé/unique à chaque individu
Nombre de personnes mourant de réactions adverses à des médicaments prescrits correctement chaque année aux USA
106 000
Nombre de personnes souffrant d’effets secondaires non mortels de médicaments prescrits correctement chaque année aux USA
2,2 millions
Médecine basée sur le contexte du profile génétique et environnemental du patient dans l’établissement d’un diagnostic
Médecine personnalisée
Sur quel concept est basée la médecine traditionnelle ?
“Educated guess” sur lequel est le meilleur traitement à prescrire (non personnalisé)
Quelles sont les étapes pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques en grande quantité, par l’utilisation d’un vecteur d’expression ?
(1) Présence d’un puissant promoteur
(2) Clonage du gène (restriction, ligation)
(3) Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates
(4) Surexpression et purification de la protéine produite en grandes quantités
