Technique de recombinant-génie génétique cellule animal

Question 1

De quoi on parle lorsqu’on dit Macromolécule en transformation génétique des cellules animales?

Answer 1

Protéines ou polysaccharides extraient des fluides
humains ou animaux:
*Produits médicinaux dérivés du Plasma (facteurs de coagulation, immunoglobulines)
*Produits médicinaux dérivés de l’urine (FSH,HCG….)
*Produits médicinaux dérivés de Tissus (héparine)
*Protéines Recombinantes
*Anticorps
*Vaccin (vivant ou inactivé)
*De plus en plus de médicaments ou traitements

Question 2

De quoi on parle lorsqu’on dit Nouveaux produits biologiques en transformation génétique des cellules animales?

Answer 2

*Thérapie Génique
*Thérapie de cellules somatiques

*Produits du « Tissue engineered »

*Définient comme “advanced therapy medicinal
product

Question 3

c’est quoi un produit issus des biotechnologie?

Answer 3

un produit suite aux:

• Technologie de l’ADN recombinant
• l’Expression est contrôlée par des gènes codant pour des protéines bioactives
• Méthodes à base d‘hybridomes et d’anticorps monoclonaux.

Question 4

Comment produire des protéines recombinantes?

Answer 4

1. ADN codant pour la
   protéine
2. l’insérer dans un hôte
3. produire la protéine
4. isoler et purifier la protéine

Question 5

C’est quoi la glycosylation?

Answer 5

c’est une modification post-traductionnelle qui contribue à la stabilité du repliment, l’adressage, la solubilité et l’antigénicité

Question 6

qu’elles modification post-traductionnelle est présents dans les cellules eucaryotes?

Answer 6

formation des ponst di-S
glycosylation
repliement

Question 7

qu’elles sont les 2 approches générales des recombiants?

Answer 7

Expression dans des cellules isolées

Expression dans des animaux/plantes transgéniques

Question 8

Nommez quelques systèmes d’expression des protéines recombinantes

Answer 8

Escherichia coli
levures
Cellules animales en culture
Plante
Mouton/chèvre/vaches/humains …

Question 9

Pourquoi utiliser E. coli en transformation génétique des cellules animals?

Answer 9

• Génétique très bien connue
• Nombreux outils de clonage/transfection commerciaux
• Facile à cultiver et peu coûteux
• Expression élevée (g/L de protéine recombinante) = ~25% des protéines totales
• Pas de modifications post-traductionnelles
• peu de Protéines riches en ponts S-S
• Faible potentiel de sécrétion

Question 10

pourquoi utiliser la levure en transformation génétique?

Answer 10

Modifications post-traductionnelles
Faciles à cultiver
Bonne expression (plusieurs centaines de mg/L)

Faible potentiel de sécrétion pour les grandes protéines
Moins de protéines produites

Question 11

Pourquoi utilisé des cellules de mammifères?

Answer 11

Production de grosses protéines recombinantes
complexes (protéines humaines, anticorps..)

Faible rendement (10 mg/L max)

Coût élevé

Question 12

C’est quoi la transfection des cellules eucaryotes?

Answer 12

Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule

Surexpression de cette protéine grâce à la machinerie cellulaire

Question 13

Comment avoir de l’ADN du donneur?

Answer 13

A partir de l’ADN génomique:
Chromosome
- Pour un organisme donné, l’ADN génomique est le même quel que soit le type cellulaire.

A partir de l’ARNm : reverse transcription
- L’ARNm diffère en fonction du type cellulaire

Polymerase Chain Extension (PCR) ou RT-PCR:
- Quand on a la séquence du gène ou celle d’un gène très homologue

Question 14

quelles sont les différence entre une transfection transitoire et stable?

Answer 14

Transfection transitoire:

• Analyse de la transfection
  à 24-72 h
  -Perte du plasmide en quelques jours

Transfection stable:

-Transfection à long terme
- L’ADN est généralement intégré au niveau chromosomique
- Isolation des clones cellulaires par dilutions limites
-Criblage par résistance à un antibiotique des clones possédant l’ADN transfecté
- 3-4 semaines

Question 15

Qu’elle est le but de la transfection avec liposomes?

Answer 15

Transfecter des cellules COS avec des constructions
plasmidiques contenant différents ADNc

Question 16

Comment inséré de l’ADN dans une bactéries chimio-compétentes?

Answer 16

 Fragilisation de la membrane par traitement chimique

 Entrée de l’ADN recombinant par choc thermique

 106 - 108 cellules/μg d’ADN

Question 17

Comment inséré de l’ADN dans une bactéries électro-compétentes?

Answer 17

 Électroporation : choc électrique

 Fragilisation de la membrane et entrée de l’ADN chargé par les pores

 1010 cellules/ μg d’ADN

Question 18

Comment faire de la transfection dans des cellules de mammifère?

Answer 18

Méthodes chimiques:
 Calcium phosphate
 DEAE-dextran
 Liposomes cationiques

Méthodes physiques:
 Électroporation
 Transfert biolistique

Question 19

Pourquoi utilisé un gun a particule pour la transfection de cellule de mammifère?

Answer 19

 Efficace pour plusieurs types cellulaires

 Efficace in vivo (foie et muscle)

 Utilisable pour vaccination à l’ADN

 Appareil disponible commercialement

 Coûteux

Question 20

Comment faire de la transformation génétique avec la chime?

Answer 20

1. construire un vecteur d’expression et l’inséré dans un organisme hôte
2. sélectionner les cellules et les clonner
3. évaluer l’éfficacité de la production

Question 21

Comment choisir sont milieu de culture?

Answer 21

La protéine est-elle excrétée par la
cellule productrice?

 Si oui = récupération dans le milieu de culture + purification

 Si non = il faut casser les cellules

**Avant de casser les cellules :
récupération de la biomasse

Question 22

Comment utiliser des systèmes ouvert pour la production de protéines recombinantes?

Answer 22

 Insertion du gène d’intérêt dans le génome de la plante ou de l’animal

 Promoteur d’expression pour contrôler la production de la protéine d’intérêt dans un tissu facile d’accès
(graine, feuille, lait)

 Récolte

 Extraction – Purification

 Mise en production ou mise en marché de la protéine