Technique Biologie Moléculaire 6 Flashcards
Quelles sont les différences entre la microscopie d’épifluorescence (large champ ou widefield) et la microscopie confocale?
Épifluorescence :
-large champ
-utilise UV pour excité les fluorophores
Confocal :
- laser pour excité les fluorophores avec longueur d’ondes bien précise
- présence d’un filtre (pinhole) = coupe lumière hors champs/focus = permet imagée un PLAN focal à haute résolution
- balayage = lent + haute résolution
-disque rotatif = plus rapide + haute résolution
Quelle est la différence entre l’immunofluorescence directe et l’immunofluorescence indirecte?
Immonofluorescence : anticorps spécifique contre notre protéine d’intérêt ou antigène
Directe = un anticorps primaire qui cible protéine d’intérêt est DÉJÀ couplé à un fluorophore pour permettre la visualisation directe en microscopie à fluorescence
Indirecte = un anticorps primaire est utiliser pour reconnaître protéine d’intérêt
Un anticorps SECONDAIRE couplé à un fluorophore reconnaît anticorps primaire
Secondaire permet visualisation indirecte en microscopie à fluorescence
Comment le FRET fonctionne?
Permet :
Observer une interaction DIRECTE entre 2 protéines
Un transfert d’énergie qui a lieu entre 2 chromophores
DONNEUR sera excité par une certaine longueur d’onde en relaxant transfert d’énergie à ACCEPTEUR
Conditions :
- chevauchement entre les spectres d’excitation
- distance de mins de 10pb entre 2 fluorophores
-orientation correcte fluorophore
Comment le FRAP fonctionne?
Permet :
-mesurer la mobilité/dynamique de diffusion des fluorophores dans un milieu donné
-mesurer l’avidité entre 2 proteines
On photoblanchie une régions d’intérêt pendant quelque seconde avec forte puissance laser
Et on observe des images en TEMPS RÉEL à intervalle régulier si oui ou non la fluorescence est redistribuer(retour normal)
Quantifier le signal de fluorescence en fonction du temps
Méthode hautement quantitative en temps réel
*toujours une fraction immobile qui récupère jamais
Comment feriez-vous pour visualiser une protéine dans une cellule?
Utilisation des techniques de microscopie à très haute résolution comme le STED, le PALM et le STORM.
Permettent de contourner la LIMITE de DIFFRACTION entre deux objets fluorescents.
• permet de suivre des petites molécules ou protéines fluorescente
