Technique Biologie Moléculaire 3 Flashcards
Après combien de cycles de PCR obtient-on la région cible de l’ADN amplifié sans ADN simple brin flottants (overhangs)?
C’est seulement au 3e cycle de la PCR qu’on verra des fragments amplifés doubles brin sans ADN simple brin (overhangs).
Quelles sont les différentes propriétés des polymérases utilisées pour la PCR?
Fragment Klenow:
- activité polymérase 5’-3’
-activité exonucléase 3’-5’ = répare erreur
- dénaturation haute température
Taq :
- activité polymérase haute température
- PAS exonucléase
- thermostable a haute température (demi vie 40min)
- inhiber par plusieurs molécules (- efficacité)
-utile clonage TA
Pfu/Deep Vent (pyrococcus) :
- très stable à haute température
- activité exonuléase
- activité polymérase
Phusion:
- amélioration de Pfu = domaine processivité amélioré
- activité polymérase 10x plus rapide
- utiliser longue amplification
- activité exonucléase
Pfx:
- activité polymérase
- activité exonucléase
-contient KOD
- hot start = - réduire présence dimères d’amorce = relâche polymérase haute température
- empêche amplification non-spécifique = (basse température)
Que se passe-t-il avec les trois phosphates du nucleotide lors d’une réaction de PCR?
Les dNTPs sont essentiels pour synthétiser nouvelle copie ADN = amplification
la polymérase, en utilisant le dNTP, catalyse l’ajout d’un phosphate lors de la formation d’un pont phosphodiester, et qu’un seul pyrophosphate inorganique (PPi) est libéré.
Pour permettre l’ajout de nucléotide pour reformer l’ADN double brins
Quelles types d’amorces peuvent être utilisées pour la RT-PCR?
- Amorce oligo dT = amplifie spécifiquement la queue poly(A) de l’ARNm
-Amorce hexamère = amplifie NON-spécifiquement l’ARNm et aussi les autres types d’ARN
Quels sont les réactifs essentiels à ajouter dans votre tube lors d’une réaction de PCR?
Les 5 composantes essentielles requises pour la réaction de PCR:
1 - Polymérase = amplifie avec matrice et polymérise
2 - Amorce = oligonucléotides simple brin complémentaire ADN amplifier
3 - Désoxynucléotides triphosphates (dNTPs) = nécessaire a amplification (synthétise nouv copie)
4 - Tampon = concentration ion/pH PCR optimal
5 - Matrice d’ADN = ADN d’intérêt
Pour la PCR quantitative, quel sont les 2 types de sonde à quelle étape voit-on le signal de fluorescence augmenter?
Types de sonde:
- SYBR Green :
- Liaison à double brin d’ADN
- Émission a 520nm
- Permet quantification d’ADN en temps RÉEL
- FRET (5’ nucléase) :
- Amorce avec un fluorophore en 5’ +molécule extinctrice 3’
- Fluorescence du fluorochrome est éteinte par molécule 3’
- Polymérase allongement fragment ADN = libération fluorochrome = émission
- Permet quantification d’ADN en temps RÉEL
Pour la PCR quantitative, quelle est la différence entre un petit Ct et un grand Ct?
Ct (cycle seuil): le nombre de cycles ou le produit d’amplification d’ADN par qPCR peut être détecté au-dessus du signal de bruit-de-fond.
Plus le Ct est petit plus l’ARNm du gène d’intérêt est abondant et vis-versa.
Comment écrieriez-vous un « message biologique » avec de l’ADN?
On peut contrôler la taille des fragments d’ADN pour créer un message en migrant cet ADN sur un gel d’agarose
Quelles sont les 3 étapes majeurs pour la PCR reproduite à chaque cycle et les décrie ?
- Dénaturation de l’ADN :
On chauffe tube entre 95-98C pour briser pont H entre paire de bases = séparation des brins - Hybridation de l’ADN :
Redescend la température du tube entre 50-70C pour que la polymérase synthétise le brin complémentaire a partir des oligonucléotides (amorce) qui viennent se coller et hybrider la séquence complémentaire sur ADN (simple brin)
-Élongation de l’ADN:
Dans une température entre 68-72C la polymérase va recruter les dNTPs qui sont au sein du système et catalyser ceux-ci pour qu’il forme pont phosphodiester afin de refaire l’ADN double brins de 5’-3’
De quoi dépend la quantité de copies d’ADN produites lors de PCR ?
Dépend du nombre de cycle
2 a la n. n = le nombre de cycles
Quels sont les avantages et inconvénient PCR ?
Avantage :
- Amplifier n’importe quelle séquence d’ADN = permet +matériel pour analyse/modification
Inconvénient:
- doit connaître séquence d’ADN à amplifier
Quel est le rôle du tampon lors de la réaction de PCR ?
- Varie selon la polymérase
- Optimisé pour avoir un pH adéquat
- Réduit les interactions non-spécifique
- Présence d’ions Mg2+:
-cofacteur polymérase
-liaison po4 ADN
-aide liaison amorce à la séquence complémentaire d’ADN matrice - Présence d’ions K+:
-lient au squelette ADN
-aide contre mésapariements non-spécifique - DMSO:
-diminue température hybridation si présence séquence riche en GC - Glycérol:
- inhiber formation de structures secondaires de l’ADN
Quel sont les 2 amorces qui se lie au fragment dénaturé et simple brin ?
- L’amorce sens 3’-5’, qui se lie au brin complémentaire (5’-3’) = reverse
- L’amorce anti-sens 5’-3’, qui se lie au brin matrice (3’-5’) = forward
Quel sont les 2 températures important pour bien désigner des amorces ?
Température de fusion (Tm):
Température a laquelle l’ADN est MOITIÉ double brins / simple brin
= indicateur de la STABILITÉ du duplex d’ADN
G-C = + / A-T = - Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Température d’hybridation:
Calculer en fonction du Tm = un peu plus haut que Tm
Influencer par = concentration amorce + sels tampon + DMSO
Quelles sont les choses à faire et à éviter lors du design d’amorces ?
A avoir:
- amorce 15-30 de long
- Tm 55-70C
- pas plus de 5C entre les 2 amorces
- 40-60% GC (uniforme)
- C ou G à l’extrémité 3’
A évité :
- structure secondaire (tête d’épingle)
- complémentarité entre les amorce (dimère)
- répétition
- + de 3 C ou G à la fin de la séquence
