Technique Biologie Moléculaire 4 Flashcards
Quel sont les étapes de l’expression génique ?
- Transcription en ARNm (5’-3’) queue Poly-A
- Épissage / épissage alternatif
- Traduction en protéines
Qu’est-ce qui régule l’expression des gènes ?
Chaque cellule possède un profile d’expression des gènes qui lui est propre. Dépendamment du tissu, du type de cellule, de l’état sain ou malade, les cellules expriment différents gènes
Qu’est-ce qu’un profile d’expression génique ?
La distribution d’un ensemble de gènes dans une conditions précise
Représente une image des gènes exprimés dans une cellule capturée à un moment précis
Pour bâtir un profil nous avons besoin de connaître les sites ou les gènes sont exprimés
Quel sont les 2 paramètres essentiels lors de l’étude de l’expression génique + fonction ?
- Échantillon de référence:
- Représente l’état de base (”normal”) auquel seront comparés les niveaux d’ARN des échantillons expérimentaux
- Permet d’établir si l’expression d’un gène est augmentée ou diminuée dans l’échantillon expérimental. - Gène (s) de contrôle :
- Utilisés pour normaliser les valeurs d’expression de gènes obtenus entre les différents échantillons étudiés.
- Doit être un gène dont l’expression ne présentent aucune variation entre les conditions des échantillons étudiées.
- On peut utiliser plus d’un gène de contrôle interne.
Quelles sont les étapes générales de la méthode de Northern Blot?
1- Isolation de l’ARN total ou Poly-A(purifier pas non-codant)
2- Migration sur gel dénaturant d’agarose = séparer les tailles d’ARN
3- Transfert sur membrane de Nylon = différenciation
4- cible d’ARN/ADN détecter par hybridation avec sonde
5- ARN ayant été hybrider avec sonde radio marquer avec phosphate 32 sur la membrane va être détecter par autoradiographie
6- l’intensité du signal ainsi que la distance de migration = quantité/taille d’ARN d’intérêt présent dans l’échantillon
permet de bien comprendre les différences entre les différents transcrit issu d’un même gène
Que signifie une bande intense dans la technique de northern blot ?
Cela veut dire que le transcrit est abondant dans l’échantillons d’intérêt
Comment le signal est normaliser dans un northern blot ?
A l’aide des sondes radiomarqué complémentaire
Quelles sont les précautions à prendre lors de la méthode Northern Blot?
Lors de l’étape d’extraction d’ARN;
-intégrité des échantillons = signal soit perçu comme une seule bande = non dégrader
Dégrader = signal diffus + perte générale de sensibilité
Quelles sont les étapes générales de la méthode de RPA?
1- ARNm extrait cellules
2- ARNm mélangé avec ARN anti-sens ou sonde complémentaire
3- hybridation brins complémentaire
4- formation ARN double brins ou hybride ARN-ADN
5- ajout RNAse S1 et RNAse A
6- clivage de tout sauf ARN hybrider
7- ARN non-hybrider sont dégrader en oligomère = nucléotide individuels
8- les fragment (restant) son précipiter a l’aide solution phénol/chloroforme
9- migration sur gel d’agarose
10- quantification de sonde = quantité d’ARNm cible dans la population d’ARN total
Comment RPA se différencie-t-elle de la méthode Northern Blot ?
- Pas de transfert sur membrane (nylon)
- Sonde hybridée avant la migration sur gel
- Les ARN non hybridés sont dégradés
- Il n’y aura qu’une seule bande par ligne sur le gel
- pouvoir supérieur de détection
À quoi servent les enzymes RNAseS1 et RNAseA dans méthode RPA ?
Il servent a cliver spécifique les simples brins d’ARN non hybrider pour ne laisser que les ARN double brins former a partir de l’ARNm d’intérêt et la sonde
Quel est l’une des premières méthodes qui visent le « haut-débit »
SAGE
Quel est le rôle des amorces oligo-dT sur les billes (ou résine) dans la méthode SAGE ?
Oligo dT(amorce) :
Petite séquence qui ne sont que des T qui vont s’hybrider de façon très forte et spécifique avec les queues Poly-A des ARNm (isole )
-amorce oligo dT qui visent à immobiliser (PURIFICATION) uniquement les ARNm qui contiennent des queues polyA.
CONCENTRATION SUR SEULEMENT ARNm
-enzyme de restriction N1a111 = extrémité cohésive 3’
-ligation
- BsmF1 coupe 10pb du site de restriction
- formation TAG = duplex
- ligation DiTAG
-digestion
- formation de concaténers
Qu’est-ce que l’ont obtient a la fin de la méthode SAGE ?
Librairie ou on a plusieurs petits fragments d’ADN qui proviennent de ARNm initial
En quoi l’utilisation d’une courbe standard permet l’aspect hautement quantitatif du qPCR ou RT-qPCR ?
Car permet d’obtenir la quantité exacte d’ARN dans l’échantillon étudié
