T9 - Técnicas de análise das variação do DNA e sequênciação

Question 1

Técnica RFLP

Answer 1

Usam-se enzimas de restrição específicas spós o PCR;
A presença de um polimorfismo ou mutação causa perda ou ganho de local de restrição, levando a uma variação no tamanho dos fragmentos de DNA;
Isto pode observar-se aquando de uma eletroforese.

Question 2

SSCP

Answer 2

1. Amplificação por PCR
2. Desnaturação da dupla hélice
3. Arrefecimento rápido (não permite que se formem duplas cadeias)
4. Eletroforese em gel de policrilamida não desnaturante

Question 3

Tamanho ideal para SSCP

Answer 3

150 pares de bases

Question 4

Heteroduplex Analysis (HA)

Answer 4

1. Amplificação por PCR
2. Desnaturação das cadeias duplas de DNA
3. Renaturação das cadeias duplas, ocorrendo formação de Heteroduplexes (cadeia normal ligada a cadeia mutada)
4. Eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante

Cadeias heteroduplexes possuem zonas de mismatch e por essa razão vão migrar menos no gel.

Question 5

DGGE (Desnaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Answer 5

1. Amplificação por PCR
2. Desnaturação por aumento da temperatura
3. Renaturação e formação de Heteroduplexes
4. Eletroforese em gel de gradiente crescente de solução desnaturante.

Hetroduplexes têm um melting point menor, por isso migram menos.

Question 6

Melting point

Answer 6

Ponto em que o DNA atinge a concentração de reagentes desnaturantes que o fazem desnaturar - interrompe a migração no gel

Question 7

Qual dos métodos físicos é ótimo para PCR Multiplex?

Answer 7

DGGE

Question 8

Qual dos métodos físicos é mais sensível a deleções/inserções?

Answer 8

HA

Question 9

Quais os fatores comuns de todos os métodos físicos

Answer 9

Precisam de PCR prévio
É necessária a sequênciação para caracterizar a mutação.

Question 10

Método enzimático

Answer 10

1. Mistura de PCR em 4 tubos, cada um com um dideoxinucleotídeo diferente (marcados radioativamente)
2. Termociclador - ciclos
3. Quando são incorporados dideoxinucleotídeos, a síntese para
4. Eletroforese em gel para os quatro tubos

Question 11

Sequênciação automática

Answer 11

1. PCR prévio
2. Um tubo com PCR com um primer e dideoxinucleotídeos, cada um marcado com uma cor diferente
3. Termociclador - ciclos
4. Eletroforese capilar
5. Eletrofluorograma