T3 - Cultivos celulares: entorno y técnicas Flashcards
¿Cuáles son los elementos del entorno de un cultivo celular?
- Sustrato
- Fase gaseosa
- Medio de cultivo
- Tº de incubación
El sustrato es la fase sólida sobre la que crecen las células en cultivo. Es importante seleccionar un medio adecuado al tipo celular.
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Puede ser sólido, semisólido o líquido
Los medios sólidos, para las células que crecen en momocapa son necesariamente de un solo uso
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Si son de vidrio se pueden esterilizar
La mayoría de células crecen en suspensión
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Solo cél sanguíneas algunas tumorales que han perdido capacidad de perder en adherencia. La mayoría crecen en monocapa.
Los soportes de vidrio son más respetuosos con el medio ambiente pero los de plástico son la opción más económica
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Plástico es más económico pero es de usar y tirar.
Vidrio es reutilizable pero suponeesterilizarlo con todo el consumo que conlleva.
Son aproximadamente igual de malos para el planeta.
Para realizar cultivos semisólidos de células que normalmente crecen en suspensión el soporte más común son geles de colágeno 3D.
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Los geles de colágeno suelen ser para cultivos sólidos 3D.
Los cultivos semisólidos se pueden hacer en colágeno, pero habitualmente se hacen en un Agar (diferente al de micro)
Dada la hidrofobicidad de los soportes de plástico, habitualmente se usan soportes de vidrio, que es hidrofílico (como las células)
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Lo más común es usar soportes de plástico, para solucionar la hidrofobicidad es plástico irradiado.
¿Con qué objetivo puede interesar realizar cultivos celulares semisólidos de células que suelen crecer e suspensión?
Si interesa clonar o aislar, porque asñi las células que proceden de una misma permanecen juntas, formando colonias
Quiero realizar un estudio sobre los efectos de la metformina sobre células de cáncer de mama triple negativo. Para ello administro una dosis de 0,05 mM, con la intención de observar los efectos a 12, 24 y 48 horas. ¿Qué tipo de soporte me interesa usar?
- Recilientrs rotatorios
- Placas con varios pocillos
- Placas individuales
Placas individuales
Porque he de estudiar las células en diferentes momentos, y así cuando estoy trabajando con unas no “Pongo en riesgo” al resto.
Quiero realizar un estudio sobre los efectos de la metformina sobre células de cáncer de mama triple negativo. Para ello administro dosis de 0,05 mM, 0,07 mM y 0,1 mM, con la intención de observar los efectos en 48 horas. ¿Qué tipo de soporte me interesa usar?
- Recilientrs rotatorios
- Placas multipocillo
- Placas individuales
Placas multipocillo
Como voy a trabajar con todas ellas a la vez, simplemente con diferentes dosis, será más cómodo y manejable.
Qué indica que una placa de cultivo (individual) sea P60?
Que tiene un diámetro de 60 mm.
¿Qué significa que un frasco de cultivo sea T-75?
Que el área del pocillo son 75 cm^2
¿Qué indica que un soporte multipocillo sea P24?
Que tiene 24 pocillos
Factores a tener en cuenta para la elección del sustrato de cultivo
- Cómo crecen las células (monocapa o suspensión)
- Escala del cultivo (cantidad de células que se necesitan) –> cuántas placas y tamaño
- Tipo de análisis (distintos tratamientos/concentraciones a un mismo tiempo o efectos a distintos tiempos) –> multipocillo o pocillos individuales.
Si tuvieses que cultivar gran cantidad de células de las que te interesa estudiar la secreción de un producto extracelular? Cómo optimizarias el estudio para gastar el mínimo medio posible?
Para evitar gastar mucho medio con placas muy grandes, usaría frascos giratorios con paredes de cristal a las que pueden adherirse las células (mayor superficie de contacto), y como van girando, el medio va bañándolo todo.
Estos frascos tienen una capacidad de 2-2,5 L, se utilizan entre 100-200 mL de medio de cultivo y tienen una superficie de unos 2.000 cm2.
Los microtransportadores son botellas de resina sintética (sephadex) cuya carga positiva permite la adherencia de células, debido a la carga negativa que estas presentan en el exterior por el potencial de membrana.
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La botella es de vidrio, en su interior hay esferas de resina.
Los microtransportadores optimizan la cantidad de células no adherentes que pueden crecer respecto a si lo hiciesen en suspensión.
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Un requerimiento imprescindible para todo cultivo es que la presión de oxígeno de la fase gaseosa se mantenga igual que la atmosférica
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A veces se debe aumentar porque puede que no llegue por difusión a todo el cultivo (especialmente si hablamos de cultivos tisulares)
El problema de la difusión de oxígeno es una característica exclusiva de los cultivos tisulares
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En cultivos de células en monocapa, si hay demasiadas células, puede haber un impedimento para la diusión.
Mantener la correcta presión parcial de CO2 en cultivo es importante simplemente por el hecho de que este regula el pH
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Sí, pero además es un sustrato requerido para reacciones biosintéticas. In vivo las células lo adquieren de la circulación, pero en cultivo debe proceder de la fase gaseosa.
¿Qué tampones se le suelen añadir a los medios de cultivopara evitar su acidificación?
Tampón bicarbonato y HEPES
Cuanto más CO2 requiere el cultivo, más HEPES y bicarbonato hay que añadir al medio
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Los requerimmientos de CO2 de un cultivo pueden variar en función del tipo celular y del medio utilizado
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Puede oscilar entre la concentración atmosférica y un 10%.
En cultivos poco densos es importante añadir CO2 porque no basta el que producen, igual que en cultivos no herméticos ya que pueden perderlo.
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A pesar de las diferencia s en composición y concentraciones de sales, todos los medios de cultivo presentan sales de Ca y Mg dada la importancia fisiológica de estos iones.
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Favorecen la agregación plaquetaria y de células en general, por lo que para trabajar con células en suspensión no se añaden.
El rojo fenol es un antibiótico presente en una cantidad significativa de medios de cultivo
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Es un indicador de pH
Las BSS (Soluciones Salinas Equilibradas) son medios de cultivo isotónicos pensados para mantener vivas las células durante periodos breves de tiempo, durante el transcurso de procedimientos experimentales.
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NOS SON MEDIOS DE CULTIVO, son soluciones isotónicas.
Algunas BSS (Soluciones Salinas Equilibradas) incluyen glucosa
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Necesaria para mentener, por ejemplo, neuronas o células tumorales
¿Cuál no es u contenido de los medios de cultivo?
- Glucosa
- Proteínas
- Vitaminas
- Sales minerales
- Nucleósidos, Pyr y ácidos grasos
- Todos son contenido de los medios de cultivo
- Proteínas
EL medio de cultivo tiene aminoácidos, pero no proteínas
Para qué sirven las BSS (Soluciones Salinas Equilibradas)?
Permiten mantener las células vivas unas 4 horas y sirven para los cultivos que se han de estudiar a corto plazo o para limpiar tejidos y para mantenerlos vivos.
Se usa mucho para hacer lavados (cuando hay que hacer un cambio de medio)
El DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) es uno de los medios más completos y cuyo uso está más extendido
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Cada tipo celular requiere de un medio muy preciso para poder crecer
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Aunque se seleccionan los medios de cultivo según las necesidades concretas de cada tipo celular, muchas células son capaces de crecer en medios diferentes.
Si, debido a sus particularidades, una célula requiere un nutriente particular, este se puede añadir al medio de forma adicional.
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Hoy en día la ética obliga a que los sueros, necesarios para el aporte de factores de crecimiento y hormonas, sean sintéticos en vez de provenir de embriones.
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Aunque existen los sueros de sustitución (sintéticos) estos son muy caros.
Por ello lo más extendido continúa siendo el uso de sueros fetales.
¿Cuál es la composición de un medio completo?
- Medio “en sí” e.g. DMEM
- Suero e.g. FBS (10%)
- Antibióticos e.g. P/S (1%)
El rojo fenol regula el pH del cultivo, que se suele mantener en 7,4
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El pH es regulado por los tampones y el CO2, el rojo fenol es un INDICADOR de pH (para controlar visualmente que este se mantiene)
La mezcla de antibióticos más común para añadir a un cultivo es penicilina y estreptomicina.
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Si un medio con rojo fenol ha virado a amarillo es porque se ha dado una contaminación con bacterias, ya que el metabolismo de estas es muy acidificante.
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Puede ser una contaminación por bacterias, pero también puede ser que la placa esté confluyente (el metabolismo de las propias células también es acidificante).
¿Por qué es más probable que el medio de un cultivo de células cancerosas se acidifique frente a un cultivo de “células normales”?
Porque las células tumorales tienen requerimiento elevados de glucosa, que a menudo acaba saturando las vías y por ello el Pyr empieza a derivarse a lactato (ÁCIDO láctico), que se expulsa al medio, acidificándolo.
Además, este lactato es un nutriente fantástico para las bacterias…
tienes la combi completa.
¿Por qué puede un medio de cultivo con rojo fenol virar a lila?
- Por contaminación fúngica (los hongos tienen metabolismo basificante)
- Por el uso de la propia botella de medio –> a medida que se va usando entra CO2 cada vez que se abre y la proporción de aire/medio va aumentando, por lo que cuando está muy vacía puede basificarse un poco.
Si en el medio de cultivo hay muy pocas células, este se vuelve básico, mientras que si la placa está confluyente se acidifica.
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Si hay pocas células se mantiene neutro.
Tanto los componentes del medio completo como las soluciones “complementarias” que se requieren se compran ya autoclavadas para asegurar su esterilidad.
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Los componentes del medio completo se compran ya esterilizados. Otras solucionnes se deben esterilizar en el laboratorio.
Pero las soluciones que incluyen proteínas o vitaminas no se pueden autoclavar en ningún caso, puesto que estos compuestos son termolábiles. Lo que se hace es esterilizarlos mediante filtración.
Para esterilizar líquidos biológicos como el suero, soluciones enzimáticas, vitaminas o antibióticos se puede recurrir a filtoros o a radiación.
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La radiación es perjudicial para estas soluciones.
En el proceso de esterilización por filtración se utilizan filtros de 0,22 µm capaces de retener partículas contaminantes como bacterias y hongos.
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Generalmente cuando se da una acidificación bacteriana del medio la responsable es Myccoplasma, una bacteria que está en el límite de diámetro de los filtros de 0,22 um y que por tanto contamina muchísimo.
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No se ve porque no altera el pH del medio y es tan peque que apenas se ve al micro.
Se identifica pq conoces a tus células y sabes su tiempo de duplicación → ves la células “sanas” pero se triplica el tiempo de duplicación. Myco se come la glucosa y por barrido electrónico se ve en la superfície de las céluals.
La filtración por presión negativa se utiliza para pequeños volúmenes de líquido utilizando jeringuillas que se rellenan con el líquido a esterilizar y se coloca en la boca jeringuilla el filtro.
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Es la definición de presión positiva
La filtración por presión negativa se realiza con grandes volúmenes de líquido, mediante la aplicación de vacío en el recipiente donde se realizará la filtración.
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Para filtrar por presión negtiva debes montar sobre tu poyata un Erlenmeyer o Kitasato con un filtro y conectarlo a una máquina que hace el vacío.
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Los filtros vienen esterilizados por radiación gamma, en el momento en que los abres fuera de cabina es un sin sentido —> no se filtra en poyata si no en cabina
Un suero contiene unos 1,4 mg de inmunoglobulinas por ml, lo que implica que existe la posibilidad, aunque pequeña, de que alguna de ellas reconozca un antígeno de las células en cultivo, fijando el complemento que inducirá su lisis.
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1,4 mg/ ml es la [inmunoglobulinas] en el medio completo, con una concentración de suero al 10%.
El suero tiene 14 mg/ml de Igs.
Para evitar una posible acción del complemento se suele descomplementar el suero mediante un baño a 56 ºC
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En el suero hay muchas proteínas que no son del complemento y que son importantes. Por ello solo se descomplementa si has comprobado que se lisan las células
Es más probable que te toque descomplementar el suero si trabajas con células “sanas” que si lo haces con tumorales.
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Por los mecanismos de evasión inmune es más difícil que las células tumorales sean reconocidas por el sistema inmune.
La temperatura es importante, la mayoría de células crecen a 37 °C, no toleran ninguna variación de temperatura, por esto, los incubadores han de controlar la temperatura de manera muy precisa.
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Pueden aguantar bien una bajada de temperatura, pero no una subida.
Clasifica los métodos de contaje de células
Métodos directos:
- Contaje manual: Hemocitómetro (cámara de Neubauer)
- Contaje automático: Contadores electrónicos
Métodos indirectos:
- Turbidez
- COntenido DNA o proteína
¿Qué se puede hacer para minimizar el error de contaje con la cámara de Neubauer?
- Se suele contar más de un cuadrante
- Se sigue siempre un mismo criterio para saber si si contar o no células que se encuentran justo al borde de un cuadrado
- Suelen contarse entre 30-300 células
Error estimado: 10%
Para extrapolar el nº de células contadas en el hemocitómetro a la concentración en cultivo se tiene en cuenta que las ranuras del hemocitómetro tienen una profundidad de 1 mm y que cada cuadrado tiene también 1 mm de lado
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La profundidad es 0,1mm
En el hemocitómetro, la columna de células que hay en cada cuadrado es de 0,1 µL o mm3 (1 mm× 1mm×0,1 mm). Se cuentan las células y se multiplican por 10^4 y se obtienen las células/mL.
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Los contadores electrónicos de células presentan un error mayor que los contadores manuales porque a veces pueden pasar dos células muy juntas que sólo dan una señal o se puede obstruir el sistema. Para evitar esto se ha de poner suspensiones muy diluidas y asegurarse que las células estén separadas.
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Aún así este error es menor que el de los contadores manuales (5% vs 10%)
Hay contadores electrónicos que realizan un análisis del ciclo celular indicando la fase, muestran si están vivas o muertas, dan el tamaño (distribución de tamaño), etc.
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Todos los métodos indirectos de contaje requieren de una recta patrón para extrapolar.
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Ya sea peso-nº de células o absorbancia/fluorescencia-nº de células
Un problema que caracteriza a los métodos indirectos de contaje es la facilidad con la que se saturan (hay un nº límite de células que pueden detectar
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El peso seco/humedad de las células no es saturable.
La turbidz o transmitancia se mide a 560-610 nm
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Las determinaciones de DNA o proteínas totales se basan en el hecho de que todas las células presentan una misma cantidad de estas macromoléculas
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Es cierto en el caso del DNA, pero los niveles de proteínas varían según la expresión, aunque se puede utilizar como método porque sí que existe una proporcionalidad + proteína = + células)
Los métodos indifrectos no pueden usarse en laboratorio, están limitados a la industria por su elevado error.
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Eso ocurre con el peso seco y la transmitancia; pero hay métodos como la cuantificación de proteínas, DNA o otras determinaciones fluorimétricas/colorimétricas que sí se usan en laboratorios analíticos.
Las células azules, cuando realizamos una cuantificación de células viables son aquellas que están muertas, de modo que su membrana, poco íntegra, ha permitido la entrada de la sustancia que se esté utilizando para la estimación.
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No se ha especificado qué técnica es:
- Es verdad para la exclusión de tinción (tripan blue)
- Es falso si se usa un método funcional como MTT; porque las sales de tetrafolio, solubles, atraviesan cualquier membrana; pero para dar azul han de ser reducidas por enzimas que, en caso de que la célula esté muerta, no estarán.
Si se usa MTT o cristal violeta para estudiiar la sensibilidad de una línea tumoral a un tratamiento… ¿qué observaremos si, en efecto, el tratamiento mata a las células?
Que a mayores concentraciones de el tratamiento, menos color (azul o violeta) veremos, porque habrá más células muertas.
Hoechst es una técnica basada en la fluorescencia de la bisbenzimida, una molécula que se une al surco menor del DNA.
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A diferencia del bromuro de etidio no se intercala entre las bases!
El método de exclusión de tinción tiene como fundamento la diferente integridad de membrana de las células vivas y las muestras. Se deben tener en cuenta las células que excluyen el tripan blue.
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¿Cómo prepararías un cultivo de explantes primarios?
- Los cultivos de explantes primarios parten del tejido diseccionado o de una biopsia.
- Se coloca en una BSS para mantenerlo en condiciones viables.
- Seguidamente se corta finamente en trozos que no tengan más de 1 mm
- Se limpia para eliminar los restos de tejidos con la misma BSS (sedimentaran los fragmentos en un tubo Corning).
- Finalmente se transfiere a un frasco o a las placas directamente (con una pipeta Pasteur empapada en el medio para que no se adhiera el tejido), se suelen poner entre 20 y 30 fragmentos.
- Se distribuyen de manera uniforme.
- Se elimina el medio de limpieza de la placa o frasco con una pipeta.
- Se va renovando el medio durante unas 2-3 semanas, tras las cuales empezará a poder apreciarse la proliferación.
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¿Cómo harías un cultivo de células disgregadas a partir del tejido original?
- Se coloca el tejido en una BSS para mantenerlo en condiciones.
- Seguidamente se corta finamente (importante) el tejido en trozos que no tengan más de 1 mm.
- Se limpia para eliminar los restos de tejidos con la misma solución salina (sedimentaran los fragmentos en un tubo Corning), con la solución BSS (balanced salt solution).
- Digestión enzimática para separar las células (colagenasa, tripsina…). También se puede hacer mecánica, si no se quiere que la tripsina interfiera con ningún componente de las proteínas superficiales de la célula. (Se suele pasar el tejido por una jeringuilla para separar por fricción)
- Se sedimentan las células y se resuspenden en medio de cultivo.
- Se realiza un contaje y la dilución pertinente para tener la concentración de células adecuada.
- Se siembran y tras incubar 2-3 días deberíamos ver proliferación.
Para hacer un cultivo de células disgregadas se limpia primero (con BSS) y se hace la digestión (enzimática o mecánica) después
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Pros y contras de la tripsina
Pros: Tº óptima = 37ºC y pH óptimo = 7,4
Contras:
- inhibidores de tripsina en el medio
- inhibida por los cationes divalentes de la BSS
- puede destruir las células si se deja demasiado tiempo
- no sirve si interesan proteínas de membrana
Esto no quiere decir que sea una m*erda, va genial para desadherir pero
Esto no quiere decir que sea una m*erda, va genial para desadherir pero hay que tomar medidas/pasos para sortear estos inconvenientes
La pepsina es una alternativa a la tripsina, con un pH óptimo de 7,5-8
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Pancreatina
Los scrappers (barrido de superficie) se usan para líneas celulares cuya dhesión al sustrato es muy fuerte, mientras que si esta es débil se suele recurrir al pipeteo repetido
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Para subcultivar con tripsina se debe retirar el medio de cultivo y realizar dos lavados con agua destilada para asegurar que se eliminan todos los inhibidores de tripsina
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Lavar con BSS, el agua destilada haría rebentar las células por osmosis
La tripsina se suele comercializar en disoluciones que ya incluyen EDTA, que actúa como quelante de los iones divalentes que median las interacciones célula-sustrato, inhibiendo la acción de la tripsina.
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Para inactivar la tripsina se añade un volumen de medio como mínimo igual al doble del volumen de tripsina utilizado.
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Mínimo el triple
Para aislar clones sembrando en una P100 debemos obtener una dilución de 100-200 células por ml, para asegurar que, considerando una eficiencia de siembra del 10%, nos sobrevivan 10-20 clones
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Se hace una dilución de 10-20 cél/mL.
Como en la P100 se siembran unos 10 mL, esperamos que se siembren entre 100 y 200 células. Entonces, considerando un 10% de eficiencia (optimista) tendríamos las 10-20 células. Una aproximación más realista es que la eficiencia sea del 5%, lo que nos dejaría con al menos 5 células superviviente, lo cual se considera el mínimo necesario.
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¿Qué podemos hacer para mejorar la eficiencia de siembra?
- Medio muy rico en nutrientes suplementado con suero fetal (muy rico en GFs) al 20% (mayor proporción que la habitual).
- Asegurar unos buenos niveles de CO2, que como tampón y sustrato debe ser abundante, para ello, si tenemos recipientes no herméticos el incubador se puede programar para que mezcle 5-10% de CO2 con el aire(más de lo habitual). Si trabajamos con frascos se puede inyectar CO2 directamente y cerrar.
- Añadir un polímero/proteína como colágeno, fibrina o polilisina sobre el sustrato –> simulan una matriz in vivo lo que estimula la proliferación.
- Añadir un medio condicionado (1/3): 1 parte de medio condicionado por un cultivo de células del mismo tipo (rico en señales pero pobre en nutrientes) en 2 partes de medio limpio (sin señales pero rico en nutrientes)
También parece ser útil usar placas P96 o anillos de clonación, que ayudan a condicionar el medio.
¿Cómo se obtiene un medio ya condicionado?
Estableciendo un cultivo del mismo tipo celular, cuando se llega a un 50% de confluencia se quita el medio (al que las células han liberado factores condicionantes) y se pone fresco, guardarlos dos días. Este medio, que será condicionado, se filtra para eliminar células y se mezcla 1/3 con medio fresco (para renovar los nutrientes se ponen dos partes de medio nuevo).
La clonación de células tiene como objetivo obtener una población de células iguales, más grande, a partir de una única célula parental. Esto es importante cuando se quieren obtener células superproductoras de alguna proteína (por ejemplo, un anticuerpo) a nivel industrial o cuando se quiere obtener una mutación concreta
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En la clonación de células, se calcula la eficacia de siembra dividiendo nº de células sembradas / nº de células formadas * 100 y se obtiene el resultado en porcentaje
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eficacia = nº células formadas / nº células sembradas * 100
Para aumentar la eficacia de siembra puede añadirse más suero y más CO2 de lo normal
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En la clonación de células, aportamos a las células separadas un medio de cultivo formado por: 1 parte de medio condicionado (viene de células en crecimiento) + 3 partes de medio nuevo, ya que el condicionado, pese a aportar señales para las células vecinas, es pobre en nutrientes
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1/3 parte de medio condicionado y 2/3 partes de medio nuevo
El medio 3:1 ayuda a mejorar la eficacia de siembra
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el medio 1/3
Los anillos de clonación son cilindros huecos por abajo y cubiertos por arriba, que se usan en las placas multipocillo.
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Son huecos por arriba y por abajo, y se usan en las placas individuales
El uso de anillos en la clonación celular para las placas individuales es un proceso que dura 2-3 días, por lo que es muy rápido.
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Dura 2-3 meses, con peligro de contaminación
Cada vez que se quiere trabajar con una línea celular debe partirse de un cultivo primario.
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Pueden congelarse las celulas, almacenando las líneas celulares largos periodos de tiempo
Congelar las células en un experimento permite crear check-points por si en un momento dado ocurre una mutación o contaminación.
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¿En qué consiste el STR profiling?
Se trata de una comprobación para asegurr que la línea celular sigue intacta, es decir, que las células siguen siendo las mismas desde su compra.
Se comprueba si más del 85% de repeticiones cortas en tándem de las células (secuencias STR) son idénticas.
¿Hay que congelar siempre en nitrógeno líquido?
No, se pueden congelar las células en congeladores. No obstante, cuanto menos frío presenta el congelador, menos tiempo duran las células.
La congelación en nitrógeno líquido no debe realizarse rápidamente, sino que se siguen pasos de enfriamiento progresivo
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De lo contrario, pueden formarse cristales o romperse los viales
Las células deben congelarse en fase exponencial (nunca en confluencia o fase de latencia) y con un crioprotector para mantener su integridad
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Tanto la congelación como la descongelación se deben realizar de forma rápida
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Congelación lenta y progresiva; Descongelación rápida en baño de 37ºC 10’
Entre el 30-40% de las células mueren en los procesos de congelación-descongelación
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Sobretodo en el último por los efectos dañinos de los crioprotectores
Al separar dos tipos de células, ¿qué es lo más importante a tener en cuenta?
Se debe usar algún criterio diferencial: tamaño, densidad, carga o componentes de la superfície celular.
Pueden tenerse en cuenta más de uno, normalmente tamaño y composición
¿Qué método de separación se aplica para cada uno de los criterios diferenciales (tamaño, densidad, carga y componenets diferenciales de la superficie celular)?
Según el tamaño: velocidad de sedimentación o elución por centrifugación (si tenemos en cuenta tamaño + composición podemos considerar también el citómetro de flujo).
Según la densidad: centrifufación isopícnica
Según carga: electroforesis líquida
Según componentes diferenciales de membrana: matriz cromatográfica, separando las células por afinidad.
La separación de células por su carga es uno de los métodos con mejores resultados, y por tanto el más adecuado.
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la mayoría de las células tienen carga neta negativa debido a la presencia de proteínas y moléculas en su superficie. La diferencia de carga entre dif celulas suele ser pequeña, lo que dificulta una separación eficiente solo basada en la carga. Se usa medio líquido y gradiente de densidad para que las células no sedimenten
En la elución por centrifugación (separación por tamaño) las células pequeñas pasan primero que las de mayor tamaño en la cámara de separación
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En la centrifugación isopícnica las células sedimentan en función de su…
Densidad
El cloruro de cesio usado en centrifugación isopícnica es perfecto para usarse sobre células por ejercer mucha presión osmótica, que es lo que estas necesitan.
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Se usa para separar DNA pero es tóxico para las células por ejercer mucha presión osmótica. Por ello, se usan otros materiales para crear el gradiente: la seroalbúmina, el dextrano, el Ficoll o el Percoll.
La cromatografía de afinidad (separación según componentes diferenciales de membrana) NO funciona con proteínas expresadas a nivel intracelular
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El proceso conllevaría romper la célula
¿Cuáles y qué señales se generan al pasar la célula por el haz de luz en citometría de flujo?
Cuando la célula pasa por el haz de luz se generan dos señales:
Una a los 180 grados (forward statter): si la célula es grande la penumbra es grande, si la célula es muy pequeña la penumbra es pequeña. Es proporcional al tamaño de la célula.
Otra a los 90 grados (side statter): Si es compleja, habrá muchos haces de luz, si es más sencilla saldrá más dispersa → permite saber la composición, que es proporcional a la complejidad de la célula.
Explica la técnica de Cell Sorting
Variante del citómetro de flujo, que evita el problema que este conlleva (las muestras se tiran tras pasar por el citómetro de flujo).
Por ejemplo, si se conoce que algunas células tienen antígenos en la superficie, se pueden tratar con anticuerpos con fluoróforos unidos. A medida que pasan las células y según la información que recibe, el aparato da una carga a las células. Según esta carga, se las hace pasar por un campo magnético que provoca su distribución hacia un lado u otro cuando pasan por unas placas con carga y al final hay un recolector de fracciones. Estas se podrán sembrar, y obtendremos una población homogénea con las características deseadas en cada tubo estéril
conviene explicar también en qué consiste la citometría de flujo
¿Para qué sirve la caracterización de las líneas celulares?
- Correlacionar el cultivo con el tejido de procedencia (saber si corresponden)
- Seguir la inestabilidad de las células (saber si siguen siendo las mismas)
- Controlar la contaminación cruzada con otras células
- Describir las nuevas líneas celulares
Enumera las formas de caracterización celular
- Estudios morfológicos con el microscopio
- Análisis enzimáticos
- Estudio de los cromosomas
- Estudio del ADN, ARN y proteínas
- Estudio de antígenos de superficie
Se usa la estrategia más adecuada para cada caso, no se usan todas cada vez.
