T2 - Laboratorio de cultivos celulares Flashcards
¿Qué condiciones debe cumplir un laboratorio de cultivos celulares?
- Asepsia
- Hábitos de trabajo
- Instrumental
Para mantener un ambiente aséptico en el laboratorio de cultivos…
a) Debe estar aislado, en ningún caso puede estar en un lugar de paso
b) No puede tener ventanas
c) La puerta de acceso debe evitar turbulencias
d) a) y c)
e) todas
d)
b) es falsa porque puede tener ventanas, aunque estas deben estar selladas herméticamente.
Un laboratorio de cultivos celulares se caracteriza por presentar 3 áreas imprescindibles: la zona de entrada, la zona limpia y la zona estéril.
F
La zona limpia no es estrictamente necesaria
En general, el objetivo prioritario es proteger al cultivo de la contaminación. Pero en el caso de utilizar patógenos la estructura se complica, ya que debe protegerse tanto al cultivo como al operario.
V
La disposición del laboratorio y el equipamiento esta determinado por las dimensiones de la sala, del número de usuario del laboratorio, el tipo de cultivos celulares, niveles de bioseguridad y calidad requeridos.
V
La zona de entrada es una antesala en la que se encuentra todo aquel aparataje que no es indispensable para el cultivo, con el fin de evitar la presencia de fuentes potenciales de contaminación de los cultivos.
F
puede utilizarse para colocar aquellos aparatos y materiales que son indispensables para la realización de los cultivos celulares, pero pueden ser fuente de contaminación para el cultivo.
Pon 2 ejemplos de equipamiento que debe encontrarse en la zona de entrada
- Sistema de refrigeración (neveras, congeladores) por las corrientes del ventilador donde se enfría el líquido refrigerante)
- Autoclaves: producen calor y vapores con corrientes de aire y turbulencias.
La zona limpia constituye una frontera estéril entre el laboratorio general (entrada) y el laboratorio de cultivos celulares (estéril)
F
Es limpia pero no estéril.
En la zona estéril es necesario trabajar con trajes de seguridad biológica
F
Solo si la zona es una habitación entera. Si se trata de una cabina se usa bata, aunqu esta debe ser para uso exclusivo en esta zona.
Una campana es lo mismo que una cabina de clase I
V
Las cabinas de flujo laminar reciben este nombre porque un motor fuerza el paso de aire a través de un filtro de forma contínua y constante, sin turblencias donde puedan quedar retenidas partículas contaminantes.
V
El fundamento de los filtros HEPA es físico-químico: el diminuto diámetro entre las fibras de vidrio (0,5-2,0 um) retiene partículas y microorganismos, tras cada uso se eliminan mediante un sistema interno de lavado con etanol volatilizado.
F
El fundamento físico es tal cual; pero para la desinfección del filtro se utiliza radiación ultravioleta, mediante un sistema ya integrado en la campana.
Las cabinas de flujo laminar tienen el objetivo de impedir la contaminación del operario
F
Algunas lo consiguen, pero su principal misión es mantener las células libres de contaminantes
Las cabinas de flujo laminar vertical son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son adecuados para el trabajo con materiales peligrosos pues el operador queda completamente expuesto. En las de flujo horizontal, se asegura una buena protección del producto, y dependiendo del diseño se puede proteger al operador, de manera que son más adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos.
F
viceversa
a) Las cabinas de clase I protegen a la muestra pero no al operario
b) Las cabinas de clase II protegen al operario pero no a la muestra
c) las cabinas de clase III protegen al operario Y a la muestra
d) Todas las clases de cabina protegen a la muestra
c)
- Clase I: protege al operario y al medio ambiente → no sirve para cultivos (son las campanas de gases, te protejes tú y hay un filtro arriba para proteger el medioambiente)
- Clase II: protege al operario, el cultivo y el medio ambiente.
- Clase III: cabina de seguridad estanca para trabajo con agentes biológicos de alto riesgo (la que tiene los guantes integrados).
Las cabinas de clase I son unidades de contención parcial, adecuadas para manipular agentes de bajo riesgo que no necesiten protección especial.
V
Las cabinas de clase II se caracterizan porque en cada ciclo, hay un porcentaje del aire que es recircilarizado y otro que se elimina
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En las de tipo 100% exhausto se elimina el 100% del aire hacia dispositivos con otro filtro que retiene los posibles agentes peligrosos.
En las cabinas de clase II tipo A el 30% del aire es recircularizado mientras que el 70% es eliminado y reemplazado por aire nuevo.
F
30% eliminado y 70% recircularizado
En cabinas de clase II tipo B el 70% del aire es eliminado y el 30% es recircularizado
V
Por qué es necesario eliminar parte del aire en las cabinas de clase II
Hay aire que entra por una rejilla frontal (para evitar la salida de agentes peligrosos). Si entrase aire y no saliese la presión aumentaría y… PUM
Las horas de uso de un filtro HEPA (800 máx) son un parámetro orientativo, no es tan relevante si se superan en el caso de las cabinas de tipo II
F
El aire flitrado incide directamente (flujo laminar vertical) sobre la muestra, en el momento en que el filtro ya está demasiado usado la muestra se contamina enseguida
Las cabinas de tipo 100% exhausto son características de laboratorios de toxicología
V
se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente contaminado.
La protección de la muestra y el operario solo depende de escoger el tipo correcto de cabina de seguridad.
F
También depende de una correcta calibración del instrumento, especialmente de las velocidades de entrada de aire y de flujo vertical. El punto de calibración o ajuste es dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 a 9 meses.
Respecto a los tipos de campanas de clase II, La tipo A, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados (filtrables) y la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos.
V
Las cabinas de tipo 100% exhausto son estancas, permiten el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo, manteniendo al agente patógeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtración y disolución de éstos.
F
Esto define a las cabinas de clase III
A parte de un medio de cultivo adecuado… ¿qué condiciones deben darse para que un cultivo celular se desarrolle?
- Humedad superior a la ambiental para evitar que el medio se evapore.
- Tº constante (específica según la especie de la que proceden las células)
- Mezcla de aire y CO2 (el CO2 es un tampón porque las células metabólicamente activas acidifican el medio) que se recircularice
El área de incubación puede ser un incubador o incluso una habitación entera
V
(aunque un incubador es lo más fácil y frecuente)
Como el incubador necesita recircularizar aire, se mantiene en la zona limpia, para evitar contaminaciones en la zona estéril
F
Se encuentra en la zona estéril
```
~~~
En los incubadores de CO2 se consigue un ambiente estéril gracias a pequeños filtros HEPA
F
Se mantiene lo más aséptico posible pero no se puede esterilizar ya que hay que abrir y cerrar la puerta.
Cuál de los siguientes no se encuentra en un incubador de CO2?
- Termostato muy fino para mantener temperatura
- Dispositivo de mezcla de aire y CO2 para mantener pH
- Sistema de radiación UV para mantener asepsia
- Control de humedad ambiente (palangana con agua)
- Dispositivo recircularización del aire
Sistema de radiación UV para mantener asepsia
El incubador no es estéril
Un incubador debe tener una temperatura fijada en 37 +/- 0,5 ºC
F
37 ºC si se trata de células humanas, pero en caso de ser de otras especies, la temperatura puede ser diferente.
Para un cultivo celular, una subida de la temperatura es más grave que una bajada.
V
Un cultivo de células humanas no es viable por encima de los 38ºC ni por debajo de los 36ºC
F
POr encima de 38ºC no es viable, pero recordar que en la centrífuga pueden estar hasta a4ºC. Una bajada de Tº hace que las células queden en una especie de latencia, pero no mueren
Algunas veces se requiere de incubadores que enfríen la temperatura ambiente respecto al laboratorio.
V
E.g. anfibios tienen una T = 26º o peces de agua fría tienen T = 18ºC… si en el laboratorio la TºC es superior debe disminuir.
Respecto a los gases en un incubador, se trata de aire ambiental enriquecido con un 10% de CO2
F
Aire ambiental + CO2 hasta que este alcanza la proporción de 5%
Es imprescindible que el O2 constituya el 21% de los gases en el incubador
F
Un 21% es normoxia, pero puede interesar…
- Porcentaje menor (hipoxia) –> ver sus efectos
- Porcentaje mayor (hiperoxia) –> céls con mayores requerimientos de O2 o ver el papel de este en la regeneración tisular.
¿Cómo se consiguen condiciones de hipoxia o hiperoxia en un incubador?
- Hiperoxia –> incubadores con una entrada específica para O2 de una bombona
- Hipoxia –> métodos químicos como añadir un quelante como el molibdato, o con cianuro.
El agua que se añade en los incubadores para mantener la humedad elevada es destilada, con el fin de evitar la proliferación de microorganismos
F
Es agua estéril, lo que se consigue autoclavándola (y, en ocasiones, con algún reactivo que evita la proliferación de bacterias, algas y/o líquenes).
Para mantener la temperatura interna homogénea, algunos incubadores tienen un dispositivo de recirculación del aire que garantiza esta homogeneidad, por ello las bandejas del incubador están perforadas
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Los incubadores secos no sirven para cultivos celulares porque no mantienen elevada la humedad.
F
Son aquellos que no tienen control de CO2, aunque en efecto, no son aptos para mantener cultivos.
Bajo ningún concepto podemos meter placas de cultivo celular en un incubador seco
F
Se pueden usar para incubaciones cortas durante procedimientos experimentales.
Las células no se van amorir por un rato y así se evita un exceso de contaminación en el incubador húmedo.
Las placas de Petri no son lo mismo que las de cultivo
V
Petri: 90 mm3
Cultivo: 100 mm3
Los cultivos celulares deben mantenerse en incubadores húmedos y placas de cultivo herméticas que eviten la contaminación
F
Las placas de cultivo no son herméticas, la tapa no encaja con la parte de abajo perfectamente porque en tal caso:
- explotaría
- no podría difundir el aire
Para investigar con cultivos celulares se deben mantener las células en un incubador o en un roller
F
Las células se incuban sin movimiento para que se depositen en el fondo del recipiente, de manera que se anclen (o si son células en suspensión, se mantienen sin precipitar.
Los rollers se usan a nivel industrial, no de investigación, pues están pensados para optimizar la producción
Los rollers permiten optimizar la superficie de cultivo haciendo rotar a gran velocidad loas botellas de cultivo, de modo que toda la superficie va entrando en cultivo y, por tanto, las células pueden crecer por toda la superfície interna del cilindro.
F
Baja velocidad
Las células pueden incubarse en una habitación caliente, lo que supone ser mucho más caro de mantener y complicado de controlar y mantener limpio y estéril.
V
Cuál no es un instrumental necesario en un laboratorio de cultivo?
a. Microscopios de campo claro
b. Centrífuga refrigerada
c. Contadores de células
d. Bombas de vacío
e. pHmetro
f. Todas son correctas
a.
Son microscopios invertidos
Cuál no es un instrumental necesario en un laboratorio de cultivo?
a. Agitadores magnéticos
b. Baños termostatizados
c. Sistemas de pipeteo
d. Autoclaves
e. Neveras, congeladores y termos de nitrógeno
f. Todos
f.
Qué diferencia un microscopio invertido de uno “convencional”?
Que la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a los microscopios ópticos convencionales.
(la fuente de iluminación arriba y los objetivos abajo)
Para observar cultivos celulares, no se usan tinciones ya que los tintes son citotóxicos; por ello, para que las muestras sean visibles se recurre a condensadores, objetivos de contraste de fases y prismas de contraste de interferencia diferencial de Nomarski
V
¿Por qué no se usan microscopios convencionales para observar cultivos celulares?
- Porque los frascos/placas de cultivo tienen un grosor de centímetro/s, y esta distancia es demasiado grande para la distancia focal de los microscopios clásicos.
- Al tener que atravesar la tapa y aire para llegar a la muestra, los índices de refracción de ambos medios son diferentes.
Estos problemas se evitan gracias a los microscopios invertidos, que permiten enfocar directamente el vidrio inferior, de unos milímetros de grosor y directamente en contacto con las células.
Aunque durante el tiempo de centrifugado se pueden alcanzar las r.p.m. que sean, los procesos de aceleración y desaceleración deben ser lentos y progresivos para evitar que las células impacten contra las paredes del recipiente y se lisen.
F
La propia centrifugación tampoco puede darse a una velocidad demasiado elevada ya que en tal caso las células también podrían lisarse.
¿Por qué la centrifugación de células de cultivo debe realizarse en centrífugas refrigeradas a 4ºC?
Porque la aceleración (gravedad) aumenta la temperatura de la suspensión celular. Si esta de entrada está a 37º, aunque aumentase un par de grados sería letal para las células.
La centrífuga puede encontrarse en la zona de entrada o en la limpia, pero bajo ningún concepto en la estéril.
Si no queda más remedio puede estar en la estéril, pero lo más alejada posible de la cabina y el incubador.
Los contadores automáticos de células detectan cambios de potencial entre dos electrodos generados por el paso de células entre ambos electrodos; de este modo, se consigue un sistema de contaje de células mucho más preciso que la cámara de Neubauer
F
Supone fiarte a ciegas; lo mejor es realizar el contaje con la cámara de Neubauer 2 veces
El baño termostatizado permite mantener a temperatura fisiológica los cultivos mientras están fuera del incubador
F
Sirven para atemperar los medios de cultivo y cualquier reactivo que vayamos a poner en contacto con las células, puesto que deben estar a la temperatura óptima de crecimiento de las células.
Los 2 tipos de autoclavado son…
- Temperatura de 135 ºC, 2,2 bares de presión y aproximadamente unos 5 minutos para material de plástico y líquidos
- Temperatura de 121 ºC, 1,1 bares de presión y aproximadamente unos 20 minutos para material quirúrgico y otros metales y material de vidrio
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- 135 ºC, 2,2 bares de presión y aproximadamente unos 5 minutos para material quirúrgico y otros
metales y material de vidrio - 121 ºC, 1,1 bares de presión y aproximadamente unos 20 minutos para material de plástico y líquidos
Los 2 tipos de autoclavado son…
- 135 ºC, 2,2 bares de presión y aproximadamente unos 5 minutos para material quirúrgico y otros
metales y material de vidrio - 121 ºC, 1,1 bares de presión y aproximadamente unos 20 minutos para material de plástico y líquidos
V
Cuando autoclavamos botellas…
Deben esterilizarse abiertas sin tapón o con el tapón desenroscado para permitir que la presión interna y externa de la botella se igualen; y si se colocan varias botellas en el autoclave no deben tocarse entre ellas.
V
- Si se tapan, estallan por la diferencia de presión
- Si se tocan la fricción entre las botellas provocada por la vibración del equipo puede hacer que alguna se rompa en el interior del autoclave.
La esterilización de absolutamente cualquier material que vaya a usarse para trabajar con cultivos debe realizarse en el autoclave
F
De todo lo que resista el calor y la presión.
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Las bombas de vacío se utilizan para eliminar los medio de cultivo de las placas y flask y para eliminar los sobrenadantes después de centrifugar las células en suspensión. Es importante mantener la esterilidad del sistema por lo que se utiliza un sistema con kitasatos para recoger el medio aspirado.
V
Menciona brevemente la snormas de acceso y limpieza de los laboratorios de cultivos celulares.
Dada la necesidad de trabajar en condiciones estériles para evitar la contaminación de las células…
- El acceso a la unidad de cultivos está restringido.
- Hay que cumplir con la legislación de riesgos biológicos - Personal altamente especializado y en continuo reciclaje
- Todos los protocolos deben de estar accesibles y redactado de una manera que cualquiera pueda entenderlos fácilmente.
- Limpieza:
- Condiciones de extrema limpieza
- Protocolos de limpieza de suelos, paredes y área - Cambio periódico de productos
- Material propio de limpieza en exclusividad
