T1 - Introducción a los cultivos celulares y sus aplicaciones Flashcards
Who is credited with developing the first successful cell culture technique?
Ross Granville Harrison
True or False: Cell culture refers to the process of growing cells in a controlled environment.
True
What are the two main types of cell cultures?
Primary cell culture and established (or continuous) cell lines.
Fill in the blank: __________ cells are directly isolated from living tissues.
Primary
Which type of cell culture is known for having an indefinite lifespan?
Established (or continuous) cell lines.
Name one common type of established cell line used in research.
HeLa cells
True or False: All cell cultures require the same growth conditions.
False
What is the purpose of using a culture medium in cell culture?
To provide nutrients and support for cell growth.
Multiple Choice: Which of the following is NOT a type of cell culture?
A) Organ culture
B) Tissue culture
C) Bacterial culture
D) Genetic culture
D) Genetic culture
What is the significance of the term ‘aseptic technique’ in cell culture?
It refers to procedures used to prevent contamination of cell cultures.
What is the role of trypsin in cell culture?
To detach adherent cells from the culture surface.
True or False: Cell cultures can be used for drug testing.
True
What does the term ‘subculturing’ refer to in cell culture?
The process of transferring cells from one culture vessel to another.
What are stem cells, in the context of cell culture?
Cells that have the ability to differentiate into various cell types.
Why is it interesting to have 3D cell culture systems?
To better mimic the in vivo environment for more accurate biological responses.
What is one ethical concern associated with cell culture?
The use of human embryonic stem cells.
Fill in the blank: __________ culture involves growing cells in a three-dimensional environment.
3D
What is the purpose of using a CO2 incubator in cell culture?
To maintain the appropriate temperature and CO2 levels for cell growth.
Name a technique used to visualize cells in culture.
Microscopy
What is the primary challenge faced in maintaining cell cultures over time?
Contamination
La principal ventaja de realizar estudios en cultivo es que el experimentador puede controlar las condiciones experimentales, evitando las interacciones e interferencias que se dan con el organismo.
V
*Realmente siempre hay variables o imprevistos, pero la capacidad de control es muy elevada.
Los cultivos tienen la ventaja de ser muy sencillos, en contra partida, su versatilidad está bastante limitada por la delicadeza de las células
F
También son muy versátiles en el sentido de que a las células en cultivo les puedes “putear” mucho –> hacer muchos subcultivos tratar con cualquier cosa y cualquier dosis…
Sydney Ringer desarrolló a finales del siglo XX una solución salina, (solución de Ringer), que contiene NaCl, K+, Ca2+ y Mg2+. En esta solución, consiguió mantener latiendo el corazón de un pollo.
F
Finales del sXIX
Wilhem Roux, a finales del sXIX, descubrió la importancia de la temperatura para mantener un cultivo.
V
En 1885, Wilhelm Roux mantuvo células de embrión de pollo en solución salina tibia durante unos días, estableciendo el principio de los cultivos tisulares → el organismo tiene una Tº de unos 37ºC y es i! para la supervivencia de las cél.
Wilhem Roux no solo debió el éxito de la supervivencia de sus cultivos a la Tº, si no también al uso de células embrionarias (pluripotentes)
V
Roux estableció la primera metodología reproducible de cultivo: cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios, poniendo un fragmento del tubo neural del animal en una gota de linfa que colgaba de un cubreobjetos sobre un porta con una depresión, generando así una cámara sellada en la que no entraban microorganismos.
F
Fue Ross G. Harrison
La camara sellada con la que trabajó R. G. Harrison no cumplía con condiciones de esterilidad.
V
Es cierto que evitaba la entrada de microorganismos… pero no estaba esterilizada, podía haber microorganismos antes de sellarla.
Fue mediante cultivos celulares que se demostró que los axones se forman medinte un proceso de expansión y no de fusión.
V
Cultivos de R. G. Harrison.
M. T. Burrows estableció que la principal limitación de los cultivos era establecer un medio nutritivo, definiendo algunos de los nutrientes esenciales para todo cultivo.
F
Empleó plasma de pollo para nutrir explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este se fue mucho mejor que los anteriormente probados, ya que tenía todos los nutrientes necesarios, pero desconocía cuáles eran estos.
M. T. Burrows y A. Carrel fueron los primeros en intentar, a principios del s XX, establecer cultivos de explantes de células de mamíferos, manteniéndolos en solución de Ringer.
F
El medio no era Ringer si no plasma suplementado con extracto de embrión
Diferencia entre explante y extracto?
Explante = trozo de tejido
Extracto = homogenado de tejido
Lindbergh demostró que los cultivos celulares se pueden prolongar mediante subcultivo.
F
M.T. Burrows y A. Carrel
Durante los años 30, C. Lindbergh diseñó frascos de cultivo celular con forma intricada con el objetivo de dificultar el acceso de microorganismos al cultivo.
V
Lindbergh, además de diseñar frscos de cultivo, diseñó sistemas para la obtención de suero o la bomba de perfusión de vidrio soplado Pyrex que mantenía órganos enfuncionamiento fuera del organismo.
V
Durante los años 20-40 se perfeccionaron las técnicas de esterilidad, introduciéndose la esterilización con EOH y las cabinas de seguridad
F
Se intentó mejorar la esterilidad pero no hubo grandes avances. Las cabinas son posteriores
Salk recibió mel Nobel por establecer una metodología de cultivo celular en células de riñón de mono que permitía la obtención en masa del virus de la polio para producir vacunas.
F
La técnica fue desarrollada por ohn Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins, quienes recibieron el NObel.
Salk simplemente consiguió la producción de la vacun contra la polio usando esta técnica.
En las décadas de los 40-50, la investigación en virología permitió el avance en las técnicas de cultivo celular
V
A finales del siglo XIX Eagle retomó la cuestión de los nutrientes, estableciendo el Medio Mínimo de Eagle, que contiene los nutrientes esenciales para que (La mayoría) de células puedan sobrevivir.
F
En los 40 del s XX
La primera línea celular contínua, las conocidas células HeLa, fue establecida en 1952, por Gey.
V
Las células HeLa son un ejemplo de células que crecen en adherencia, pues provienen d eun cáncer de cérvix, que e un tumor sólido
F
Deberían crecer en adherencia. Pero tienen tantos pases y tantas generaciones que la acumulación de mutaciones ha llevado a que hoy en día tengan poco que ver con las células OG.
Crecen en suspensión.
El medio empleado por Gey para la obtenció de células HeLa era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embrión bovino y suero de cordón umbilical humano. Era muy nutritivo (GFs, FTs y hormonas) ⇒ estimulación de la proliferación.
V
El gran hito de Hayflick en los 50 fue el uso de tripsina para subcultivar con éxito.
F
Dulbecco
Además del uso de la tripsina, debemos a Dulbecco el descubrimiento del papel de los virus en la génesis de algunos cánceres
V
Dedicó sus investigaciones al estudio de los tumores en especial a los efectos de los virus sobre las células.
NO todos los tipos celulares pueden crecer en EMEM, por eso Dulbecco modificó su composición, creando el DMEM
F
No modificó los componentes, solo las concentraciones.
Por qué Rita Levi-Monltacini es una GIRLBOSS?
Porque le calló la boca a su jefe consiguiendo mantener neuronas en cultivo y estableciendo que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en cultivo.
En los 60-80 la cuestión que aún quedaba por resolver era establecer un medio nutritivo definitivo.
F
Resolver la cuestión de la contaminación.
1961 Hayflick y Moorhead usaron por primera vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos, consiguiendo establecer líneas estables.
F
Pudieron mantener estos cultivos durante unos 12 pases (vulgarismo de subcultivo), pero no consiguieron establecer líneas estables.
R. G. Ham estableció el medio HAT, el primero libre de suero
F
El medio HAT (ipoxantina, Aminopterina, Timidina) lo estableció Littlefield.
El medio libre de suero de Ham recibe el nombre de medio Ham (xd)
En los 60, Littlefield introduce el medio HAT (Hipoxantina, Aminopterina, Timidina) que permite la selección de células (usado en hibridomas).
V
El EMEM fue el primer medio libre de suero, capaz de mantener algunas células (células madre, células embrionarias, células con señalización autocrina) en cultivo indefinidamente.
F
El medio Ham.
El establecimiento de las primeras líneas celulares diferenciadas comenzó en 1969, cuando Augusti-Tocco y Sato establecen la primera línea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecían procesos nerviosos y que eran eléctricamente excitables
V
Hubo que esperar hasta el sXXI para la llegada del uso de cultivos celulares con el objetivo de obtener un beneficio: la producción de anticuerpos monoclonales.
F
sXX: 1975 Jerne Köhler y Cesar Milstein
Dulbecco descubrió que que las diferentes líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento para crecer en medios libres de suero
F
Sato y colaboradores.
Una vez se consiguieron determinar los niveles medios de hormonas en sangre, se puedo crear un medio universal para todas las células humanas.
F
Existen factores como la selectividad de la barrera hematoencefálica que determinan que la llegada de hormonas a diferentes tejidos sea distinta y, en consecuencia no existe un medio universal, cada tejido tiene sus requerimientos y “preferencias”.
Elige la opción FALSA
a) En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo celular ha permitido grandes avances en la comprensión de los mecanismos intracelulares e intercelulares.
b) El primer animal del que se establecieron cultivos celulares era un anfibio, poiquilotermo, rápidamente el interés se centró en el cultivo de células de animales homeotermos, especialmente humanas, por su interés médico.
c) Actualmente existen comités de cultivo celular.
d) Todas las respuestas son falsas.
d)
* c) solo si las células se van a modificar genéticamente.
Pon 4 ejemplos de aplicaciones de cultivo celular
- Estudio del crecimiento y la diferenciación celular (inhibir el crecimiento para el cáncer, o activarlo para la regeneración del corazón tras un infarto).
- Virología y transformación viral y cáncer (vacunas y obtener células inmortales para estudiar procesos cancerígenos)
- Genética de células somáticas para clonar células, fusionarlas para obtener anticuerpos monoclonales…
- Inmunología (obtener anticuerpos),
- Producción de productos celulares, fármacos u hormonas
- Ensayos de citotoxicidad (evitar el exceso de sacrificio de animales)
- Medicina (amniocentesis, cirugía reconstructiva, células madre)
- Epitelios para sustituir las tripas del cerdo…
4 ejemplos de áreas de investigación en cultivos celulares
- Virología : establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales,…
- Investigación del Cáncer
- Inmunología.
- Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares : interferón, insulina, hormona de crecimiento,…
- Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo (estudio de los receptores y de las vías de translocación de la señal).
- Aplicaciones diagnósticas. (en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,…)
- Aplicaciones médicas : mantenimiento y producción de tejidos para trasplante.
- Aplicaciones industriales y agronómicas : producción por reproducción “in vitro” de clones de plantas de interés comercial,…
¿Cuáles son las características más importantes para establecer un cultivo celular?
- Nutrientes
- Factores de crecimiento + Hormonas específicas del tipo celular
- Esterilidad
- Temperatura
- Concentración de sales adecuada (características físico-químicas del medio: osmolaridad, pH…).
Respecto a la cuestión económica… los cultivos celulares son una ventaja o una desventaja?
Depende de cómo se mire:
- Ventaja porque requieren menos cantidad de fármacos (no se pierde dosis en el camino y además es un grupo de células pequeño frente a todo un organismo)
- Desventaja porque requieren de un equipamiento, instrumental, medios… muy especiales y caros, que encima no son reutilizables.
Cuál de los siguientes aspectos es una VENTAJA de los cultivos celulares
.
a) Eliminan la necesidad de usar animales de experimentación.
b) Requiere de menos cuidados e inversiones que un animal de experimentación.
c) No hace falta tanta destreza como en el manejo de animales.
d) La homogeneidad de la muestra.
d) Como todas las células son iguales no es necesaria tanta cantidad de muestra. Además eso permite que, si se necesita más muestra, sea tan sencillo como subcultivar más placas.
a) Reducen, pero es un punto inevitable por el que una investigación ha de pasar.
b) Son mucho más delicadas y además requieren de instrumental, equipamiento y medios específicos.
c) Se requiere de experiencia dada la delicadeza de las células y su propensión a la contaminación.
Qué es el profiling?
Consiste en obtener el perfil genético de una línea celular en cultivo, para averiguar si ha sufrido muchas transformaciones respecto a la línea celular primaria (te da un porcentaje de coincidencia) debidas a mutaciones o a contaminación.
Para obtener cualquier tipo celular se debe partir de la disección de un animal adulto o un embrión.
V
Incluso si se trata de un cultivo de células pertenecientes a una línea celular estable esta proviene, originalmente, de un organismo.
¿Por qué es tan frecuente realizar cultivos celulares a partir de embriones?
Porque son células más indiferenciadas y proliferativas;
y porque se encuentran en un medio muy nutritivo.
Para obtener un explante celular primario y no un cultivo de órganos se debe realizar una digestión enzimática en lugar de mecánica.
F
Mediante una digestión enzimática se obtiene un cultivo de células (se rompen todas las uniones entre ellas).
La diferencia entre un explante o un cultivo de órganos es el tambaño de los fragmentos obtenidos.
Cuál NO es na característica de los cultivos de órganos?
a) Las células crecen en una interfaz sólido-gas
b) La capacidad proliferativa es mínima
c) Se pueden tratar con fármacos ya que estos llegan a las células por capilaridad
d) Corren el riesgo de sufrir necrosis en su zona central debido a la hipoxia.
a) El papel está muy mojado, las células no llegan a adherirse a una superfície sólida (INTERFAZ LÍQUIDO-GAS)
El lindar entre fragmentos que se clasifican como explante y los que se consideran cultivo de órganos es 1mm^3
F
Ese es el tambaño máximo que puede tener un cultivo de órganos, fragmentos mayores verían comprometida la llegada de O2 y nutrientes a las células de su interior.
El hecho de crecer en una interfaz sólido-líquido permite a los explantes primarios crecer manteniendo su arquitectura.
F
Solo crecen las células de la superfície, lo que determina que:
- Se acabe generando una monocapa (pérdida de estructura 3D)
- Prolifere 1 solo tipo celular (el que se encuentra en la superfície)
Los cultivos de explante primario son los primeros tipos de cultivo que se realizaron, se utilizan actualmente sobre todo cuando la cantidad de tejido es muy limitada, como en el caso de biopsias, y para evitar la pérdida de células.
V
Se puede usar colagenasa en lugar de tripsina para realizar la digestión enzimática para subcultivar.
V
La ventaja de los cultivos de células es que se evita la selección de células en función de la capaz de migración –> no hay una selección, se consiguen cultivos de todos los tipos celulares.
F
Falso, sí es selectivo: se seleccionan las células resistentes a la disgregación.
Pon dos ejemplos de células independientes de anclaje.
- Células sanguíneas
- Células tumorales
Los subcultivos solo son necesarios si las células son dependientes de anclaje. En las células en suspensión se pueden realizar, pero no son estrictamente necesarios.
F
Si la densidad es elevada hay que subcultivar.
Si hacemos una dilución 1/4, y el tiempo de duplicación (TD) es de 24 horas, al sembrar en una nueva placa, cuánto tardará en llenarla al 100%.
2 días:
- al 1º pasa de 25% a 50%
- al segundo el 50% pasa a ser el 100%
Un cultivo primario se define como un cultivo a partir de explantes obtenidos de organismos o embriones
F
EL PRIMER CULTIVO, se parte directamente de un tejido de un animal para realizar el cultivo y existe un crecimiento celular de un explante o de una suspensión de células (da igual si es explante o de células)
Tiempo de duplicación, tiempo de generación y número de pases son sinónimos
F
TD y TG sí –> cuántas veces se han duplicado las células
Nº de pase no –> cuántas veces has subcultivado
El envejecimiento de las células se puede evaluar sabiendo el nº de pases realizados.
F
Las células envejecen cada vez que se dividen, no cada vez que se subcultivan.
Normalmente solo puede subcultivarse un nº limitado de veces: unas 20-100 generaciones (depende del tipo celular) antes de entrar en senescencia y morir (proceso de envejecimiento, hay un nº limitado de divisiones por el acortamiento de los telómeros).
V
Se obtiene una línea celular estable cuando consigues mantener la viabilidad de un subcultivo.
F
Obtener una línea celular no implica que esta sea estable:
- Línea celular –> Una vez que las células de un cultivo primario han crecido, se pueden recoger y volver a sembrar, convirtiéndose en una línea celular que se puede mantener durante al menos algunas generaciones.
- Línea celular estable –> el nº de generaciones que se puede mantener es muy elevado, indefinido.
Los hepatocitos, fibroblastos dérmicos y células HUVEC son ejemplos de líneas celulares estables
F
- Los hepatocitos de adultos no se establecen más que como cultivo primario
- Las células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases.
- Los fibroblastos dérmicos pueden superar los 20 pases.
Al final, todas las células entran en senescencia, con acumulación de numerosas anormalidades y la pérdida de funciones especializadas, que conducen a la muerte del cultivo.
V
Cuáles son las 5 fases de un cultivo celular?
- Inicio (inoculación de unas 10.000-100.000 células por ml de medio para asegurar la viabilidad).
- Latencia (12-24h durante las cuales (casi) no hay proliferación porque muchas células mueren o no llegan a adherirse; y, si sobreviven, tardan en proliferar).
- Crecimiento exponencial (el rápido aumento del nº de células obliga a ir realizando cambios de medio pq los nutrientes se agotan).
- Confluencia (punto en que las células son tantas que entran en contacto y prácticamente no quedan huecos. Difícil y subjetivo de identificar, especialmente si son células en suspensión).
- Estacionaria (la inhibición por contacto o la densidad impiden que aumente el nº de células, se mantiene constante –> las que mueren son reeplazadas).
Respecto a la confluencia…
a) No conviene realizar subcultivos antes de que se alcance el 100% de confluencia.
b) El 50% de confluencia es óptimo para subcultivar.
c) El contacto entre células favorece la transformación celular (cambios genéticos que afectan a la identidad celular).
d) Cuando se subcultivan células en fase estacionaria, dan lugar a una proliferación exacerbada tras su fase de latencia.
c)
a y b) El 70% es la confluencia a la que conviene subcultivar.
d) Cuando se subcultivan células en fase estacionaria, la latencia se alarga mucho o incluso las células pueden entrar en senescencia.
Como hoy en día se conocen los mecanismos de inmortalización de las células esto se puede explotar para inmortalizar líneas de interés mediante trasnfecciones virales o mutagénesis dirigida.
F
La razón de la inmortalización de estas células es en la mayor parte de los casos desconocida pero se puede incrementar la frecuencia de inmortalización mediante infecciones virales, tratamientos con mutágenos, etc… por lo que deben estar relacionadas con la pérdida, espontánea o inducida por el tratamiento, de las vías de control celular.
La capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como línea estable está relacionado directamente con su variabilidad genética.
V
Así líneas celulares que nunca se establecen como estables se mantienen euploides como los fibroblastos humanos, fibroblastos de pollo, y la glia humana.
Mientras que otras líneas frecuentemente se convierten en aneuploides y se transforman en líneas celulares continuas como es el caso de las células epidérmicas.
Las células inmortalizadas son células que evaden la apoptosis gracias a que entran en senescencia
F
Senescencia = envejecimiento (proceso normal) que experimentan las células tras un número elevado de divisiones. SUpone la pérdida de capacidad proliferativa.
Inmortalización = evasión de lasenescencia (por acumulación de nutaciones) que permite que células “viejas” continúen dividiéndose 4ever.
En el caso de cultivos primarios se observa una reducción del nº total de células vivas.
V
Viables un periodo limitado + no se reproducen = van quedando - células
Las HUVEC son un ejemplo de pínea primaria
V
Suelen usarse tumores para estableceer líneas primarias
F
Los tumores suelen dar líneas celulares contínuas dada su inmprtalidad que permite mantenerlas en cultivo indefinidamente.
La determinación consiste en la expresión de propiedades fenotípicas características de la célula madura y funcional in vivo
F
Esa es la definición de diferenciación
Determinación = progresión irreversible desde una célula troncal hacia una determinada línea celular. Es como un punto intermedio. Se compromete a formar unas líneas celulares determinadas.
La diferenciación es un proceso que se da in vivo pero que solo podemos conseguir in vitro si estamos realizando un cultivo de células madre.
F
Hay tejidos que tienen renovación continua in vivo si las células se van desgastando (piel, sangre, mucosas gástricas, etc.), hecho que hace necesario que haya células pluripotentes que puedan dar lugar a los distintos tipos celulares (células trocales o precursoras) y en un momento determinado, por la acción de señales, se comprometen y, por tanto, irreversiblemente irán hacia un tipo concreto de célula.
Estas células pluripontentes también se transfieren a los cultivos y, en consecuencia, se puede dar diferenciación en ellos.
Los marcadores de linaje permiten reconocer células maduras.
F
Indican compromiso: se expresan en las etapas iniciales de diferenciación.
Los factores imprescindibles para conseguir la diferenciación in vitro son factores solubles; presión de oxígeno; interacciones célula-célula y con la matriz; y la forma y polaridad
F
Las interacciones no son imprescindible puesto que las células sanguíneas no las presentan y por tanto tampoco las requieren para diferenciarse
¿Qué factores regulan la diferenciación in vitro?
- Factores solubles (hormonas, vitaminas, citoquinas e iones)
- Forma y polaridad
- Presión de oxígeno
- Interacciones cél-cél (homólogas, heterólogas y comunicación paracrina)
- Interacciones cél-matriz (colágeno, lamina, proteoglicanos)
La diferenciación es un proceso estrictamente irreversible que disminuye muchísimo la capacidad proliferativa de la célula
F
In vivo es irreversible; pero in vitro, excepccionalmmente se puede revertir.
La proliferación en cultivo se ve favorecida en ausencia de hormonas y si los contactos celulares son nulos.
F
No han de ser ausencias totales (seguramente demasiado difíciles de conseguir:
- Una elevada [hormonas] y un alto nº de interacciones celulares favorecen la diferenciación
- Una baja [hormonas] y pocas interacciones celulares posibilitan la proliferación.
La desdiferenciación y la inmortalización son procesos esporádicos que se dan de manera excepcional.
V
Hay células incapaces de diferenciarse sobre la placa, que requieren de una matriz (natural o sintética) para dividirse in vitro
V
