sujet 4 Flashcards
Quelle est la différence entre les cultures primaires et secondaires de tissus normaux ?
Les cultures primaires sont les cellules prélevées à partir de tissus et maintenues en culture pour quelques jours ou semaines (se divisent pas ou très peu). Elles ne se propagent pas. Les cultures secondaires, sont quant à elle, capables de divisions cellulaires in vitro, et peuvent être propagées.
Qu’est-ce qu’un passage (culture secondaire)?
Les cellules comme elles se divisent, tapissent le fond du pétri jusqu’à confluence où elles tapissent le fond du pétri (jusqu’à 100%). Après, on redilue les cellules, pour qu’elles se propagent. On divise le pétri en 3 pétris pour produire le plus de cellules possible.
Est-ce que les cellules de la culture secndaire se divise à l’infini?
Non, elles cessent de se diviser, après environ 50 divisions, à cause du principe de sénescence. (raccourcissement des télomères, dommages à l’ADN)
Est-il possible de cultiver des cellules “immortelles”?
Oui, on les appelle les “lignées” de cellules. Elles prolifèrent très rapidement, et expriment la télomérase. Elles sont souvent prélevées, de tumeurs. Elles meurent difficilement, à cause de leur croissance rapide.
Qu’est-ce que la lignée de cellules Hela ?
C’est la première lignée de cellules prélevées d’une tumeur cervicale sur la patiente Henrietta Lacks, en 1951. Elles ont été cruciales pour la recherche, on a développé le vaccin contre la polio avec ces cellules, on a fait du clonage, etc.
Quel est le litige avec les cellules Hela ?
La patiente sur laquelle les cellules ont été prélevées, sans son consentement et la famille apprend l’existence des cellules, seulement en 1973. En 2013, le génome complet de ces cellules a été rendu accessible au pulic, mais est retiré après l’inquiétude de la famille. Après avec le consentement de la famille, la séquence est accessible au public, mais sous accès restreint. En 2021, la famille poursuit Thermo-Fisher, pour avoir utilisé les cellules sans leur consentement.
Quels sont les deux approches envisagées pour modifier la fonction d’un gène ?
La surexpression ou la suppression (knock-out, knock-down).
Comment faire la surexpression d’un gène ?
On clone la partie codante du gène d’intérêt dans un vecteur d’expression (dans MCS). Ces vecteurs ont des promoteurs forts et constitutifs qui permettent la surexpression du gène. Ensuite, ce vecteur est transfecté dans les cellules en culture et on peut observé la surexpression du gène. Dans ces vecteurs, il y a également des marqueurs de résistance (de sélection).
Qu’est-ce que Pcmv ?
C’est un promoteur viral d’un vecteur d’expression qui permet de surexprimer le fragment placé en aval.
Comment est-il possible d’insérer le vecteur d’expression dans la cellule afin de permettre la surexpression de notre gène d’intérêt ? (4 méthodes)
La transfection (précipités de sels ou liposomes), l’infection (virus spécialisé), l’électroporation, la micro-injection (dans le cytoplasme).
Qu’Est-ce que la méthode de précipités de sels ?
L’ADN est sous forme solide, et la cellule finit par ingérer l’ADN.
Quels sont les limites de la transfection ?
Certains types cellulaires sont difficiles à transfecter. De plus, les plasmides ne sont pas tous répliqués de façon épisomale chez les eucaryotes (ils vont exister dans la cellule et être dégradé après certaines divisions), donc c’est seulement une transfection transitoire.
Qu’est-ce qu’une transfection stable ?
On établit une lignée stable, dans laquelle le transgène sera exprimé de façon stable. On place les cellules en culture et on sélectionne seulement celles qui ont résisté à par exemple, un antibiotique, dont le vecteur d’expression avait un marqueur de résistance. Ensuite, parmi ces cellules, on conserve seulement celles qui se divisent.
Comment les virus sont-ils utilisés pour entrer l’ADN dans la cellule ? Quels virus sont utilisés ?
C’est efficace pour introduire l’ADN dans des cellules difficiles à transfecter. Le virus choisit possède un tropisme particulier, qui est sa capacité à cibler des cellules précises. Les rétrovirus, lentivirus, adénovirus, sont les plus utilisés.
Quel est le cycle de vie des rétrovirus ?
Le virus à ARN infecte une cellule, une copie d’ADN est produite, l’ADN est inséré au génome. De nouvelles copies sont créées, par la transcription d’ADN. Les gènes d’encapsidation sont exprimés, de nouveaux virus sont créées. La cellule se lyse.
Comment est-il possible d’intégrer l’ADN d’intérêt dans la cellule par l’usage de virus comme vecteur, sans que le virus se réplique dans la cellule ?
Comme les virus encapsident seulement ce qui trouvent entre 2 LTR (long terminal repeat). Donc, le transgène qu’on veut mettre dans la cellule, est entouré de 2 LTR. Le virus qui reconnaît les LTR comme les frontières de son génome, va ensuite, intégrer seulement la construction qu’on veut exprimer. (dans le virus, il n’y a aucun ARN viral). Les cellules d’empaquetage (env., gag., pol.) naturelle des virus sont encore présentes, et empaque seulement notre construction. Le virus est toujours capable d’infecter, mais insère aucuns gènes qui confère la réplication du virus.
Quels sont les avantages de l’infection lentivirale ?
Elle est plus efficace que la transfection, elle a la capacité d’infecter des cellules quiescente (neurones), et a le tropisme, donc la capacité de cibler des cellules précises.
Brièvement, quelle est la différence entre knock-out et le knock-down ?
Le knock-down est la destruction de l’ARNm, est plus rapide avec le système d’interférence à ARN, et est efficace environ à 85%-99%. Le knock-out, est la suppression du gène dans l’ADNm qui est plus long, mais efficace à 100%.
Qu’est-ce que l’origine de la méthode d’interférence à ARN.
Il s’agit de petit ARN db, (21-23 nucléotides) peuvent être produits par la cellule elle-même par la protéine Dicer, qui est un mécanisme de défense immunitaire naturellement présent chez certain organisme et permet de détruire les génome d’intrus infectieux. Dicer, lorsqu’un ARN db entre la cellule, les clive en petits morceaux, et ces ARN db, sont reconnus par le complexe RISC ( qui contient la protéine argonaute), qui se conserve un seul brin, et qui se sert du brin conservé, pour s’hybrider contre les ARN cible et les coupe. Les organismes font donc une collection de complexe RISC pour se défendre contre les infections virales secondaires.
Comment la méthode d’interférence à ARN est appliqué ? Quels sont les 2 approches ?
On a seulement à concevoir des ARN db qui vont cibler les ARNm qu’on veut étudier dans la cellule. Les approches sont : 1) la synthèse et transfection d’ARN db ou 2) la construction d’ADN permettant l’expression d’un ARN tige-boucle (21-23 nucléotides), qu’on transfecte.)
Expliquez l’approche de la synthèse directe de l’ARN db dans la méthode d’interférence à ARN.
On construit un ARN, avec un brin sens et un antisens, dont les nucléotides se chevauchent sur environ 19 à 23 nucléotides. On ajoute des U cohésifs en 3’ et on transfecte dans les cellules. On ajoute 100 nucléotides après le AUG et 100 nucléotides avant le codon stop.
Expliquez le méthode des ARN tige-boucle transfecté directement.
On construit un petit ARN en tige boucle, avec une seule molécule d’ARN qui se replie sur elle-même. On en fait plutôt l’ADN et lorsqu’il est transcrit, c’est le structure tige-boucle, qui est transcrit et forme la tige boucle- reconnu par Dicer, et qui s’associe avec RISC, Il est aussi possible d’utiliser de concevoir des shRNAm à l’aide de vecteur d’expression, du lentivirus.
Quel est l’avantage et l’inconvénient de l’approche ShRNA.
L’avantage est que c’est moins coûteux, car après qu’on aille conçu l’ADN on peut le conserver et après re réutiliser autant qu’on veut. Toutefois, moins de siRNA sont produits et demande beaucoup plus de criblage.
