sujet 2

Question 1

Nommez 3 exemples d’application du génie génétique

Answer 1

(1) médicine (production massive de molécules importantes comme l’insuline) (2) industrie (élimination de déchets toxiques, comme le mercure, à l’aide de bactéries) (3) agriculture (amélioration des espèces : résistance aux parasites, abondance, qualité alimentaire, etc.)

Question 2

Puisque le Growth Hormone gene n’est pas toujours exprimé dans les cellules du saumon, comment faut-il faire pour qu’il soit toujours exprimé ?

Answer 2

On peut créer une protéine fusion, en fusionnant, en amont du GH gene, le metallothioenin promoter, qui lui est exprimé de manière constitutive, ce qui permet une expression constante du GH gene.

Question 3

Qu’est-ce que lien phospodiester dans l’ADN ? Où est-il situé ?

Answer 3

Il s’agit du lien en le bout 3’ OH d’un sucre et le bout 5’ phosphate d’un autre sucre.

Question 4

Qu’est-ce qui retient les bases azotés ensemble dans la structure à double hélice de l’ADN ?

Answer 4

Il s’agit de ponts hydrogène

Question 5

L’ADN est au pas droit ou gauche ?

Answer 5

droit

Question 6

Comment appel-t-on les sucres constituant l’ADN ?

Answer 6

Les désoxyriboses

Question 7

Quel est le nom complet de ces abréviations :

A ? T ? G ? C? U ? N ? dNTPs ?

Answer 7

A : adénine
T : thymine
C : cytosine
U : Uracile (seulement sur l’ARN, à la place de T)
N : n’importe quel des 4 nucléotides
dNTPs : désoxyribonucléoside triphosphate quelconque

Question 8

Quel est le sens d’ADN utilisé par défaut ?

Answer 8

5’ –> 3’

Question 9

Lorsque l’ADN polymérase ajoute des nucléotides, elle clive 2 …. du dNTPs et libère 1 … ? L’extrémité hydroxyle est alors lié avec l’extrémité … ?

Answer 9

phosphates, pyrophosphate et phosphate.

Question 10

l’ADN et l’ARN sont composées de sucres appelés désoxyriboses. Vrai ou faux ?

Answer 10

Faux, l’ARN est composé de ribose. L’ARN est simple brin.

Question 11

Comment l’ADN est mesuré ?

Answer 11

En pb (paire de base) ou b (base). Souvent pour l’ADN double brin (db), l’unité pb est utilisée, alors que pour l’ADN simple brin (sb), l’unité b est utilisée.

Question 12

Que signifie l’unité de mesure : kb ? kbp ? Mb ? Mbp ?

Answer 12

kb ou kbp: 1000 b / bp

Mb ou Mbp: 1 000000 b / bp

Question 13

Nommez 6 outils du clonage moléculaire classique

Answer 13

enzyme de restriction, ADN ligase, PCR, Vecteurs et hôtes bactériens, sélection des clones positifs, ADN complémentaire

Question 14

Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction ?

Answer 14

C’est une endonucléase qui hydrolyse l’ADN à une séquence spécifique correspondant au site de restriction

Question 15

Tous les sites de restrictions sont des palindromes. Vrai ou faux ?

Answer 15

Faux

Question 16

Est-ce que la coupure générée par l’enzyme de restriction est symétrique ? À quel endroit précisément sur l’ADN se fait la coupure ?

Answer 16

Non, parfois elle génère des bouts 5’ saillants ou des bouts 3’ saillants qui seront des bouts cohésifs, ou elle génère des bouts francs. C’est le lien phosphodiester (entre le sucre et le phosphate) qui est coupé par l’enzyme de restriction.

Question 17

Est-ce qu’une enzyme de restriction reconnaît plusieurs sites de restriction ?

Answer 17

Non, elle n’en reconnaît qu’un seul.

Question 18

Est-ce que tous les bouts d’ADN un fois coupé par l’enzyme de restriction peuvent se recoller ensemble ?

Answer 18

Non, seulement ceux qui sont complémentaires peuvent le faire.

Question 19

D’où provient le nom des enzymes de restriction, par exemple EcoR1 ?

Answer 19

Le nom provient des espèces à partir desquelles ils sont isolés. EcoR1 provient de E. coli, souche R, enzyme 1.

Question 20

Quels sont les sites de restrictions les plus communs ?

Answer 20

Les palindromes à 6 pb.

Question 21

Quel est la chance de tomber sur le bon site, pour une enzyme de restriction de 6 pb dans un génome.

Answer 21

1 site à chaque 4000 pb

Question 22

Quel est le rôle de la T4 ADN ligase ?

Answer 22

Rejoindre de manière covalente les extrémités collants ( ou cohésives en 5’ ou 3’) d’ADN en catalysant un lien phosphodiester entre le sucre et le phosphate

Question 23

Est-ce que les extrémités francs ont besoin de complémentarité pour se recoller ?

Answer 23

Non, et justement peut être problématique quand on pense à la directionnalité.

Question 24

Comment est-il possible de rendre des bouts francs afin qu’il se recolle ensemble ?

Answer 24

Avec l’activité des exonucléase, des polymérases, et des endonucléases sb.

Question 25

Quel est l’activité de la klenow (t4 polymérase) ?

Answer 25

elle a une activité polymérase en 5’ –> 3’ (donc pour les bouts 5’ saillants) et une activité exonucléase 3’ –> 5’ (pour les bouts 3’ saillants)

Question 26

Comment peut-on rendre un bout 5’ saillant franc ?

Answer 26

Utiliser la klenow (ou T4 poly) pour polymériser en 5’ –> 3’ (avec des dNTPs) ou avec la nucléase S1 ou Mung bean pour enlever les extrémités 5’ saillantes.

Question 27

Comment peut-on rendre un bout 3’ saillant franc ?

Answer 27

Utiliser la klenow (ou t4 poly) ou S1 ou Mung Bean pour enlever les nucléotides de 3’ –> 5’

Question 28

qu’est-ce que l’activité étoile ?

Answer 28

C’est l’hyperactivité de l’enzyme de restriction qui coupe des sites qui ne sont pas des palindromes normal. Arrive en présence de conditions d’incubation non-optimal. Ex : glycérol trop élevé, trop d’enzyme, sels insuffisants, pH trop élevé …

Question 29

Nommez 3 différences entre l’ARN et l’ADN

Answer 29

sur le sucre, dans l’ADN, il y a la présence d’un H seulement alors que pour l’ARN, la présence d’un OH. L’ARN contient l’uracile alors que l’ADN contient la thymine. L’ADN est souvent db et l’ARN sb.

Question 30

Qu’est-ce que provoque la méthylation des sites

Answer 30

Existe pour certain site de restriction, lorsque ce site est méthylé par les méthyltransférase de E. Coli ( reconnaissant des sites spécifiques) et peut bloquer les sites de restrictions

Question 31

Quel site spécifique reconnaît Dam et Dcm reconnaissent ?

Answer 31

Dam reconnaît GATC et Dcm reconnaît CCATGG

Question 32

À quoi sert l’électrophorèse de l’ADN ? verd quel pôle l’ADN migre-t-il ?

Answer 32

Il s’agit d’un gel qui sert de matrice poreuse (souvent de l’agarose) où on dépose l’ADN dans un puit, et il migre vers le pôle positif selon son poids. Le fragment d’ADN peut être purifié à partir d’un gel et ensuite isolé.

Question 33

Comment s’assurer que les bouts francs se colleront ensemble dans la bonne directionnalité avec la T4 ligase ?

Answer 33

Couper avec 2 enzymes différentes pour générer 2 extrémités aux séquences différentes

Question 34

Qu’est-ce qu’un vecteur et quels sont les différents types de vecteurs ? Quelle souche bactérienne est l’hôte le plus fréquent ?

Answer 34

Le vecteur sert à transporter l’ADN. Il y a les plasmides (+fréquents), bactériophages, cosmides, minichromosomes. E. Coli est l’hôte le plus fréquent.

Question 35

Qu’est-ce qu’un plasmide ?

Answer 35

ADN extrachrosomaux circulaire

Question 36

Quels sont les caractéristiques importantes des vecteurs ?

Answer 36

Ils peuvent être introduit dans l’hôte par transformation ou transduction (bactériophage), ils peuvent se répliquer dans l’hôte grâce à leur propre origine de réplication, ils contiennent des sites de restrictions unique appelés MCS (multiple cloning site), ils contiennent des marqueurs de sélection comme des gènes de résistance aux antibiotiques, de couleur.

Question 37

Une fois que le vecteur est transformé dans E. Coli comment faut-il choisir la bonne colonie ?

Answer 37

La sélection des clones positifs de E. coli se fait grâce au gène de résistance aux antibiotiques et à l’aide de la couleur blanc/bleue

Question 38

Qu’est-ce que permet le gène de résistance à l’antibiotique ?

Answer 38

Il permet de résister, donc de pousser, en présence d’un antibiotique. (ex : ampicilline). Par contre, ce ne sont pas tous les clones qui possèdent notre gène d’intérêt.

Question 39

Après la résistance aux antibiotiques, comment sélectionner la colonie basée sur la couleur ?

Answer 39

Le MCS est présent dans le gène LacZ du vecteur qui encode la B-galactosidase qui est capable naturellement de couper une molécule de galactose (galactose lié avec n’importe quel substrat). sur le pétri on met le X-Gal, et en temps normal, B-galactosidase dégrade le X-Gal et le produit X non-lié émet une couleur bleue. Si l’insert est présent dans le clone, le Lac Z n’exprime plus de B-galactosidase, donc, impossible de dégrader X-Gal, donc la colonie reste blanche. ON VEUT LA COLONIE BLANCHE !!

Question 40

À quoi sert le PCR ? Quels sont les étapes

Answer 40

Le PCR sert à amplifier un bout d’ADN. Les étapes sont les suivantes : (1) dénaturation à 95 C (2) renaturation-refroidit pour qu’amorces s’hybrident contre le brin matrice à 55 C (3) élongation à 72 C la polymérase fait son travail. Ces étapes sont répétées 30 à 40 fois.

Question 41

Qu’est-ce qu’une amorce ?

Answer 41

Bout d’ADN qui est complémentaire au brin matrice qu’il faut répliquer dans la réaction PCR.

Question 42

Comment le PCR est-il possible ?

Answer 42

Grâce à la TAQ polymérase qui provient d’une espèce de bactérie qui résiste à des températures très élevées (termophilus aquaticus - vivent à 70 degré dans les sources d’eau chaude). On peut même bouillir l’enzyme. Elle a été trouvée au Mushroom Pool au Parc de Yellowstone.

Question 43

Quelle est la caractéristique principale de la TAQ ?

Answer 43

La température d’hybridation est très élevée, ce qui offre une meilleure spécificité d’hybridation.

Question 44

Qui a améliorer le principe de PCR en utilisant la TAQ ?

Answer 44

Karry B. Mullis en 1983. Il est devenu riche et célèbre et a gagné un prix Nobel.

Question 45

Pourquoi les amorces s’hybrident sur les brins complémentaires dans la PCR ?

Answer 45

Car, les amorces sont en excès par rapport à la qte d’ADN, donc l’ADN a plus de chance de s’hybrider sur une amorce que sur son brin complémentaire.

Question 46

Qu’est-ce que le Tm ?

Answer 46

Température à laquelle l’amorce va fondre ou se réhybrider. Statistiquement parlant, c’est l’état où 50% de nos amorces sont double brin et 50 % sont simple brin. Le Tm dépend de la séquence d’ADN. Plus il y a de GC dans la séquence, plus la force des lien est forte, plus le Tm est élevé. Plus l’ADN est long, plus le Tm est élevé aussi.

Question 47

Quelles amorces doit-on choisir lorsque nous voulons faire la réaction de PCR, basé sur le Tm ?

Answer 47

Pour donner une température de renaturation qui atteint 55 C, près de 100% des amorces doivent être renaturer.

Question 48

Qu’est-ce que la transcriptase inverse ? À quoi sert-elle ?

Answer 48

La transcriptase inverse est une polymérase spéciale isolée à partir de rétrovirus qui peut polymériser de l’ADN à partir d’une matrice d’ARN. Elle est utile, car l’ADN génomique des eucaryotes comporte énormément d’introns, donc il est préférable d’utiliser l’ARNm (qui comporte seulement les exons, qui sont les séquences codantes de la protéine). Donc, la transcriptase inverse, à partir de l’ARNm peut produire un ADN complémentaire (cDNA).

Question 49

Qu’est-ce qu’une banque ? À partir de quelles amorces la banque est-elle créée ?

Answer 49

C’est une collection de fragments d’ADN provenant d’un échantillon donné. À partir d’amorce universelles, donc TTTTT, car les ARNm ont tous une queue poly A.

Question 50

Qu’est-ce qu’une protéine fusion ou chimère ? À quoi sert-elle.

Answer 50

Une protéine qui provient de deux ou plusieurs gènes qui confère un gain de caractéristiques importantes pour plusieurs applications (ex : étiquettes protéiques)

Question 51

Donnez un exemple d’étiquette protéique.

Answer 51

La protéine GFP qui émet une fluorescence spécifique, qui ne présente aucune toxicité, utilisée comme marqueur biologique. On peut créer des protéines fusions protéine-GFP pour suivre l’insert.

Question 52

Qu’est-ce que veut dire “N-terminal” ?

Answer 52

En avant du gène d’intérêt

Question 53

Qu’est-ce que veut dire “C-terminal”?

Answer 53

Après le gène d’intérêt

Question 54

Quels sont les codons STOP ?

Answer 54

TAG, TGA, TAA

Question 55

Qu’est-ce qu’un linker ?

Answer 55

Région entre les 2 gènes de la protéine fusion constitué d’acides aminés hydrosolubles flexibles sans structure particulière. (souvent des sites de restrictions) qui sert à ne pas nuire le gène d’intérêt.

Question 56

Est-ce que le clonage classique est possible pour créer des protéines fusion ?

Answer 56

Plus ou moins, il faudrait être très chanceux pour trouver des sites de restrictions au bon endroit dans les deux et que les sites respectent le cadre de lecture.