sujet 3

Question 1

Qu’est-ce que la mutagénèse ?

Answer 1

C’est le changement des nucléotides dans l’ADN d’un être vivant.

Question 2

Quels sont les 3 types de mutations possibles de l’ADN ?

Answer 2

La délétion, l’insertion et la substitution

Question 3

Quels sont les effets des mutations sur les régions codantes ? (3)

Answer 3

La mutation non-sens (terminaison -STOP), la mutation silencieuse, la mutation faux-sens (changement de résidu)

Question 4

Quel impact peut avoir une mutation sur l’expression d’une protéine ?

Answer 4

La mutation peut avoir pour effet la perte ou le gain de la fonction de la protéine, ou peut apporter un changement au niveau de la régulation d’une protéine.

Question 5

Expliquez la mutagénèse aléatoire.

Answer 5

La mutagénèse aléatoire, se fait avec l’aide d’agents mutagènes (ex : produits chimiques) pour causer des mutations au hasard. Cette méthode est utilisée en génétique classique avec le criblage génétique.

Question 6

Expliquez la mutagénèse dirigée.

Answer 6

La mutagénèse dirigée se fait avec l’aide d’ADN recombinant et d’outils moléculaires pour causer des mutations précises, normalement à un seul endroit du génome. Elle est possible par recombinaison homologue et endonucléase programmée (ex: Crispr-Cas9)

Question 7

Existe-t-il seulement un type de mutagénèse ?

Answer 7

Non, il existe la mutagénèse aléatoire et la mutagénèse dirigée.

Question 8

Que veut-on dire lorsqu’on parle de “cassettes” d’ADN ?

Answer 8

La cassette d’ADN est fabriquée en laboratoire et contient un marqueur de résistance, flanqué de séquences homologues pour une région donnée, permettant la recombinaison homologue.

Question 9

Expliquez brièvement le mécanisme de mutagénèse dirigée par la recombinaison homologue.

Answer 9

Avec la cassettes d’ADN, les séquences homologues recombinent avec l’ADN cible, permettant le remplacement allélique. Donc, le marqueur de sélection remplace dorénavant le gène cible original.

Question 10

Qu’est-ce que le mécanisme de recombinaison homologue ?

Answer 10

C’est un mécanisme de réparation de l’ADN sur le lien phosphodiester, qui se sert d’une ADN identique, pour en faire une copie exacte.

Question 11

Vrai ou Faux ? Le mécanisme de recombinaison homologue est un mécanisme sans erreur.

Answer 11

Vrai

Question 12

Pourquoi la recombinaison homologue mène parfois à des échanges d’ADN ?

Answer 12

Ceci arrive lors de méiose, lorsqu’il y a recombinaison homologue avec enjambement “cross-over”. Voir https://www.youtube.com/watch?v=3qgBKrAZCLg

Question 13

Nommez 5 méthodes d’insertion de l’ADN dans les organismes.

Answer 13

1) Transformation
2) Transfection
3) Infection
4) Électroporation
5) Biolistique

Question 14

Qu’est-ce que la transformation ?

Answer 14

L’ADN est introduit directement dans l’hôte, chez les bactéries ou levures. (organismes unicellulaires). On mélange les bactéries avec l’ADN et on leur donne un choc, pour les stimuler à intégrer l’ADN.

Question 15

Qu’est-ce que la transfection ?

Answer 15

L’ADN est introduit par précipités de sels ou par liposomes, chez les organismes comme les cellules mammifères ou les plantes.

Question 16

Quel avantage confère la transfection par par liposomes?

Answer 16

Les liposomes ont les mêmes caractéristique amphiphilique les phospholipides, donc une partie hydrosoluble et une partie hydrophobe. L’avantage est qu’on peut créer des vésicules qui possède le morceau d’ADN d’intérêt, et les cellules l’absorbe par endocytose, et pas fusion des membranes, l’insère dans son génome.

Question 17

Qu’est-ce que l’infection ? Quels sont ses avantages ?

Answer 17

L’ADN ou ARN est introduit par des virus spécialisés à l’intérieur des cellules. C’est extrêmement efficace et spécifique, mais demande de manipuler les virus, donc enjeu de sécurité.

Question 18

Qu’est-ce que l’électroporation ?

Answer 18

Il s’agit du passage d’un courant électrique qui force la cellule à intégrer un bout d’ADN

Question 19

Que veut-on dire lorsqu’on parle du “tropisme” ?

Answer 19

C’est la capacité du virus à cibler des cellules spécifiques.

Question 20

Qu’est-ce que la biolistique ?

Answer 20

Bombardement par particules couvertes d’ADN chez les plantes et les cellules mammifères.

Question 21

Nommez quelques applications des manipulations génétiques.

Answer 21

1) Biotechnologiques (en agriculture la résistance aux herbicides, aux insectes, à la sécheresse, et en élevage, pour améliorer la quantité ou la qualité des animaux
2) Recherche fondamentale et biomédicale (améliorer la santé humaine, mieux comprendre le mécanisme moléculaire des vivants)

Question 22

Est-ce que le glyphosate (round-up) est permis en Europe ?

Answer 22

Non, avec le principe de précaution, le round up, est bani en europe.

Question 23

Quels sont les applications du round up au Canada ?

Answer 23

Usage domestique et agriculture.

Question 24

Parlez des poursuites contre Monsanto aux États-Unis.

Answer 24

Le jury à tranché que le round-up cause le cancer, donc Monsanto a été condamné à payé 80 millions à un retraité américain.

Question 25

Qu’est-ce que le round up ?

Answer 25

C’est un herbicide qui bloquent la synthèse d’acides aminés aromatiques. Donc, la plante finit par mourir.

Question 26

Est-ce que le round up est breveté ?

Answer 26

Elle fait partie du domaine public depuis 2000, mais elle avait été breveté par Monsanto.

Question 27

Comment Monsanto est parvenu à créer le round up ?

Answer 27

Elle a identifié les bactéries déjà résistante à l’herbicide. Ces bactéries, champignons, protistes et plantes possèdent l’inhibiteur EPSP synthéthase.

Question 28

Qu’est-ce que le gène EPSP ?

Answer 28

C’est une mutation naturelle du gène CP4, qui résiste naturellement à l’herbicide. L’EPSP est isolé des organismes et utilisé pour modifier génétiquement les plantes, pour leur conférer une résistance à l’herbicide round-up. Donc, les plantes génétiquement modifiés sont résistantes au round-up.

Question 29

Quel est l’avantage des plantes génétiquement modifiées de Monsanto ?

Answer 29

Il est possible de faire l’épandage de round,up et de tuer seulement les mauvaises herbes.

Question 30

Quels sont les problématiques liés au glyphosates ? (2)

Answer 30

1) Il y a l’apparition naturelle d’herbes résistantes non désirées, à cause de l’épandage par avion, et le glyphosate n’a ainsi plus aucun effet sur les plants, le champ est contaminé, car l’épandage massif favorise la résistance pour des plants indésirables.
2) Il y a potentiellement un effet cancérigène chez les humains, mais il y a peu d’études là-dessus.

Question 31

Quels sont les organismes modèles les plus utilisés pour comprendre les mécanismes biologiques des vivants ?

Answer 31

Les bactéries (E. Coli), les champignons, les plantes, les animaux (vers plats, mouches à fruits drosophiles, souris)

Question 32

Pourquoi avoir recours à des organismes modèles procaryote dans la recherche ?

Answer 32

On utilise par exemple, E. Coli, pour améliorer les outils de la biotechnologie, notamment avec les vecteurs de clonage, l’expression de protéines recombinantes, la mutagénèse, etc.

Question 33

Quelle levure excelle en recombinaison homologue ? Y-a-t-il d’autres avantages à cet organisme modèle ?

Answer 33

La levure à bière est excellente en recombinaison homologue. Aussi, elle pousse rapidement en milieu solide et liquide, et il est très facile d’obtenir des clone et elle est très bonne pour comprendre les mécanismes moléculaires fondamentaux des humains : réplications, réparations, transcription, etc.

Question 34

Le vert plat et la mouche sont excellent pour la recombinaison homologue ?

Answer 34

Non, ils ne sont pas bons en recombinaison homologue. Par contre, ils sont d’excellents modèles pour comprendre les principes moléculaires et génétique du développement.

Question 35

Est-ce que les organismes mammifères modèles sont excellent pour la recombinaison homologue ?

Answer 35

Non, ils ont plutôt tendance à faire de la recombinaison non-homologue, donc à seulement recoller les bouts. Par contre, ils sont excellents pour comprendre les maladies humaines et les mécanismes spécifiques aux mammifères.

Question 36

Comment les souris sont utilisés comme modèles ?

Answer 36

Depuis, les années 80’, elles sont utilisés pour produire des souris transgéniques, surtout par des “knock-out”, pour pouvoir étudier le gène, ce qui est facile à faire lorsque celui-ci est retiré de l’organisme. Par contre, c’est difficile et coûteux, car les souris ne sont pas de bons modèles pour la recombinaison homologue.

Question 37

Pourquoi la recombinaison homologue pose problème chez les organismes modèles mammifères ?

Answer 37

Parce que la plupart du temps, la cassette d’ADN portant le marqueur de résistance et l’homologie de part et d’autre, s’insère aléatoirement au génome par la recombinaison non-homologue. Donc, cela créer plusieurs faux-positifs, car les cellules sont biens porteuses de la résistance à l’antibiotique, mais pas nécessairement à l’endroit du génome qu’on avait préalablement ciblé. Cette insertion aléatoire est fortement dépendante de la présence d’une cassure de l’ADN à proximité du site d’insertion.

Question 38

Quel est le but d’utiliser une endonucléase programmé ?

Answer 38

Créer un site de coupure double-brin à un endroit précis de génome, apportant l’opportunité de modifier le génome à l’endroit où la coupure s’est produite.

Question 39

Nommez 3 endonucléases programmées.

Answer 39

1) Zinc fingers
2) Talen
3) Crispr-Cas9

Question 40

Qu’est-ce les Zn fingers ?

Answer 40

C’est un motif protéique qui se lie à l’ADN spécifique. L’idée de la structure est qu’elle est stabilisée par un atome de zinc en son centre. Il existe une variété de Zn fingers (avec certains changements au niveau des acides aminés de l’hélice) qui donne la capacité de lier des séquences précise dans l’ADN avec les acides aminés. Lorsque plusieurs domaine Zn fingers sont fusionnés ensemble, ils reconnaissent alors une séquence spécifique.

Question 41

Quels sont les avantages/inconvénients des Zn fingers ?

Answer 41

avantages : elle fut une percée majeure au momemnt de son développement et était la seule manière précise de cibler une cassure dans un génome animal.
Inconvénients : elle est très couteuse, demande beaucoup de mise au point, fort risque de sites “off-target”. (toxicité et mutagénèse)

Question 42

Comment les Zn fingers arrivent à créer une coupure à un endroit précis sur l’ADN ?

Answer 42

Avec la combinaison de plusieurs motifs Zn fingers ensemble, permet de cibler une région spécifique de plusieurs nucléotides de long. Les motifs sont associés à la Fok1, une endonucléase non-spécifique, qui une fois dimérisé, arrive à effectuer une cassure double-brin, donnant l’opportunité d’insérer une séquence nouvelle ou de faire une délétion partielle.

Question 43

Qu’est-ce que l’approche TALEN ?

Answer 43

C’est basé sur une structure présente chez les bactéries, permettant à celles-ci de se lier spécifiquement à une séquence donnée. Il s’agit du motif TAL effector (TALE) qui est constitué de modules répété de 33-34 acides aminés et les modules diffèrent seulement aux a.a. 12-13. Ces motifs sont encore une fois associés à la fok1 qui créer une coupure.

Question 44

Quels sont les avantages et les inconvénients de la méthode TALEN ?

Answer 44

Avantages : Elle offre une meilleure spécifié que ZFN, moins de clivage “off-target”, donc moins de risques de mutagénèse involontaires, moins de toxicité.
Inconvénients : Difficile à construire par génie génétique, car très grosse molécule, et difficile à introduire dans les cellules.

Question 45

Quels sont les avantages et les inconvénient de la méthode Crispr-Cas9 ?

Answer 45

Avantages : Design simple ( guide ARN seulement), construction facile, moins dispendieux, peu de sites “off-target” (= à TALEN), peu dispendieux au point de vue matériel,
Inconvénients : risque d’acquisition du gène crispr cas9 par les cellules cibles, risque de mutagénèse involontaires après la sélection des cellules transgéniques

Question 46

nommez 3 applications de la méthode CRISPR/CAS9.

Answer 46

1) mutagénèse in vivo
2) mutagénèse in vivo par ciblage de deux sites proximaux
3) Recrutement de protéines diverses à un site spécifique

Question 47

Expliquez brièvement le système CRISPR/CAS9

Answer 47

C’est une endonucléase programmée. C’est un complexe qui s’associe avec un ARN guide et le complexe peut ensuite s’associer à l’ADN.

Question 48

Qu’est-ce qui guide le complexe CRISPR/CAS9 au bon endroit sur l’ADN ?

Answer 48

C’est l’ARN guide.

Question 49

D’où provient le système crispr/cas9 ?

Answer 49

C’est un dérivé d’un système immunitaire bactérien contre les transposons, les plasmides et les virus. Le mécanisme fait en sorte de garder en mémoire des bouts d’ADN de l’intrus infectieux et lors de 2e infection par le même organisme, le combat est plus simple grâce au système, grâce à son système cas9. Elle insère l’ADN exogène dans son génome au locus CRISPR. Ensuite, elle peut transcrire ce locus en ARNm , et celui-ci s’associe avec l’ARN tracr qui vient s’assembler avec cas9 encodé dans le génome de la bactérie.

Question 50

Voir vidéo

Answer 50

https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8

Question 51

Quelle est la structure de l’ARN guide (sg RNA)

Answer 51

C’est une séquence de 20 nucléotides en forme de tige boucle.

Question 52

Qu’est-ce que la séquence PAM?

Answer 52

Il s’agit de la séquence reconnu par CAS9 qui suit le site qu’on veut cliver. C’est cette séquence qui diffère selon le type ou l’espèce de cas9 qu’on choisit.

Question 53

Qu’est-ce que le spacer

Answer 53

C’est la séquence d’environ 20 nucléotides qui est présente sur l’ARN guide et qui peut être appariée avec l’ADN db pour amener la reconnaissance spécifique d’une séquence.

Question 54

Qu’est-ce que le protospacer ?

Answer 54

Séquence d’ADN qui correspond au spacer en aval de la séquence PAM.

Question 55

Nommez 3 différentes applications de CRISPR/CAS9.

Answer 55

Le clivage double brin (mutagénèse in vivo), la mutagénèse in vivo par ciblage de 2 sites proximaux, le recrutement de protéines à un site spécifique.

Question 56

Expliquez comment le clivage double brin fonctionne avec la CAS9.

Answer 56

Le clivage double brin est pratique dans la mutagénèse dirigée et nécessite l’activité nucléase cas9. On peut soit fournir une cassette pour que la recombinaison homologue se produise ou bien sans fournir de cassette, la recombinaison non-homologue se produit, apportant des mutations (délétion/insertion), donc une altération des protéines.

Question 57

Est-il possible d’utiliser 2 sites CAS9 pour causer des cassures double brin décalées ? Si oui, quel en est l’avantage ?

Answer 57

Facilite la recombinaison homologue et augmente la spécifié, car il y a 2 sites plutôt qu’un seul.

Question 58

Est-il possible de muter la CAS9 pour qu’elle ne cause plus de cassure ? Si oui, quel en est l’avantage.

Answer 58

Oui, on peut muter CAS9, pour seulement la recruter à un endroit précis du génome, pour soit activer un promoteur ou l’inhiber, ou même pour ajouter un marqueur comme le GFP. Pour conférer un contrôle épigénétique.

Question 59

Quelle activité de Cas9 est nécessaire pour causer une cassure simple brin ?

Answer 59

L’activité nickase.

Question 60

Comment est-il possible de recruter la cas9 à un endroit précis SANS qu’elle cause une cassure ?

Answer 60

Elle doit être mutée pour perdre son activité endonucléase. Elle est associé ensuite pour créer une protéine fusion, avec soit un activateur, un répresseur, ou le GFP.

Question 61

Nommez une solution pour réduire le risque d’acquisition du gène Cas9 par les cellules cibles.

Answer 61

Au lieu de transfecter le gène cas9, on transfecte la protéine avec l’ARN guide à l’aide de liposomes ou de particules de rétrovirus modifiées. Ceci réduit le risque de “off-target”, car la protéine ne peut pas se répliquer dans les cellules cibles. La protéine finit par disparaître par dilution. Par contre, les coûts sont plus élevés.

Question 62

Nommez 2 approches d’application de CAS9 dans la modification des allèles de gènes défectueux.

Answer 62

Il y a l’approche ex vivo et in vivo. Ce sont les cellules souches, qui sont ciblés.

Question 63

Qu’est-ce que l’approche ex vivo dans l’application de Cas9 ? Pour quelles maladies est-elle utilisée et quels sont les dangers ?

Answer 63

Les cellules du patients sont isolés, on les modifie, on les multiplie (in vitro), et on les réinjecte au patient. C’est utilisé pour traiter les cancers du sang, l’anémie falciforme, la B-thalassémie, etc. Il y a un danger de greffe, mais peu élevé.

Question 64

Qu’est-ce que l’approche in vivo dans l’application de Cas9 ? Pour quelles maladies est-elle utilisée?

Answer 64

On injecte directement la particule Cas9, (par une cellule virale qui cible), dans les tissus affectés. C’est , utilisé dans la neuropathie optique héréditaire de Leber, l’amyloïdose, la transthyrétine, etc.

Question 65

Parlez du cas des bébés GM ?

Answer 65

En 2018, un chercheur asiatique (He Jiankui) a modifié de le gène CCR5, qui permet de résister au VIH avec CRISPR/CAS9. Le gène CCR5 a été découvert, car des gens, à cause d’une mutation du gène CCR5, résiste naturellement au VIH. Donc, la mutation confère une résistance. Deux filles sont nées d’un père séropositif, et d’une mère non-infectée.