stypwma koykidas 2 Flashcards
RNA-DNA dot blot:
Έλεγχος διαφορικής έκφρασης γονιδίων που μας ενδιαφέρουν:
✓ διαφορετικού αναπτυξιακού σταδίου
✓ διαφορετικού ιστού
✓ διαφορετικού οργανισμού
DNA-DNA Dot blot:
PCR προϊόν ενός συγκεκριμένου γονιδίου, από διάφορους οργανισμούς,
χρησιμοποιώντας ένα ή μερικά από αυτά ως ανιχνευτές (ανάλογα με το
ερώτημα).
* Έλεγχος εξελικτικής συντήρησης ενός γονιδίου
* Γονοτύπηση (ASO, RFLP)
* Ανίχνευση knockout/transgenic οργανισμού
ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΟ ΖΩΟ:
ΌΛΑ ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΧΟΥΝ ΤΟ ΙΔΙΟ ΓΟΝΙΔΙΟΜΑ,
ΣΤΟ ΟΠΟΙΟ ΌΜΩΣ ΕΧΟΥΜΕ ΠΑΡΕΜΒΕΙ (ΓΙΑ
ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ, ΑΠΟΣΙΩΠΗΣΗ, ΕΚΤΟΠΗ
ΕΚΦΡΑΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ). Εδώ για την έκφραση
του αφύσικου για τα ποντίκια γονιδίου της
Green Fluorescence Protein…
Knockouts:
Μια ειδική κατηγορία διαγονιδιακών
ζώων
– Ποντίκια όπου έχουν αντικατάσταση του φυσιολογικού
γονιδίου με μεταλλαγμένο ή απενεργοποίηση τμήματος
ή όλου του γονιδίου
– Το τροποποιημένο DNA τοποθετείται σε εμβρυϊκά
βλαστικά κύτταρα, όπου ανασυνδυάζεται με το υπάρχον
γονίδιο στο χρωμόσωμα
* Ομόλογος ανασυνδυασμός
– Τα τροποποιημένα ES κύτταρα εισάγονται στο
φυσιολογικό έμβρυο και το έμβρυο εμφυτεύεται στη
μητέρα
A knockout, as related to genomics, refers to the use of genetic engineering to inactivate or remove one or more specific genes from an organism. Scientists create knockout organisms to study the impact of removing a gene from an organism, which often allows them to then learn something about that gene’s function.
Υβριδισμός σε μικροσυστοιχίες DNA –
ταυτόχρονη
ανάλυση δεκάδων χιλιάδων γονιδίων
→ Ανάλυση του συνόλου του DNA ή RNA ενός τύπου κυττάρων
Μικροσυστοιχίες DNA.
(Α) Παράδειγμα συγκριτικής ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης σε
καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα. mRNA από καρκινικά και
φυσιολογικά κύτταρα χρησιμοποιείται ως μήτρα για τη σύνθεση
cDNA. Τα δύο cDNA σημαίνονται με διαφορετικές φθορίζουσες
χρωστικές (με κόκκινη φθορίζουσα χρωστική το cDNA των
καρκινικών κυττάρων και με πράσινη το cDNA των φυσιολογικών
κυττάρων) και χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές. Οι δύο ανιχνευτές
αναμειγνύονται και υβριδίζονται με μια μικροσυστοιχία DNA που
περιέχει ολιγονουκλεοτίδια τα οποία αντιπροσωπεύουν 10.000 ή
περισσότερα διαφορετικά ανθρώπινα γονίδια. Το επίπεδο
έκφρασης κάθε γονιδίου στα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με
εκείνο στα φυσιολογικά κύτταρα συνάγεται από την αναλογία
μεταξύ κόκκινου και πράσινου φθορισμού σε κάθε στίγμα της
μικροσυστοιχίας. (Β) Φωτογραφία ενός τμήματος της
μικροσυστοιχίας.
ΠΕΙΡΑΜΑ Α:
Έλεγχος της διαφορικής
έκφρασης γονιδίων, σε
επίπεδο RNA από
διαφορετικά αναπτυξιακά
στάδια ενός οργανισμού
ΠΕΙΡΑΜΑ Β:
Έλεγχος της παρουσίας ή μη
διαγονιδιακών περιοχών ή
γονιδίων σε κάποιο υπό
μελέτη γονιδίωμα
η
πειραματική
διαδικασία
περιλαμβάνει
τα εξής
στάδια:
Ι. Προετοιμασία μεμβρανών
ΙΙ. Προϋβριδοποίηση -
Υβριδοποίηση ανιχνευτή
ΙΙΙ. Απομάκρυνση ανιχνευτή -
Εμφάνιση σήματος
Για κάθε γονίδιο που ελέγχουμε →
1 ανιχνευτής!
Ποια είναι η αναμενόμενη έκφρασή τους
στα διαφορετικά στάδια ανάπτυξης του
εντόμου?
pvw metaferetai to dna apo to gel stin memvrani
το δνα μεταφερεται και σταθεροποιειται απο το πηκτωμα σε μια θετικα φορτισμενη μεμβρανη με ροη του ρυθμ δτος που συμπαρασυρει και το δνα το οποιο συνδεεται στη μεμβρανη
τροποποιηση τεχνικης στυπωματος?
στυπωμα τυπου νοθερν για ρνα.Δινει πληροφοριες για τηνποσοτητα και οχι το μεγεθος του μρνα
στυπωμα φουεστερν
H ανάλυση τύπου Nothern
έχει βρει ευρεία εφαρμογή στη διερεύνηση της
γονιδιακής έκφρασης, όπως για παράδειγμα στον
προσδιορισμό: i) των ιστών ή κυτταρικών τύπων
που μεταγράφουν ένα συγκεκριμένο γονίδιο, ii)
των αναπτυξιακών σταδίων κατά τη διάρκεια των
οποίων παρατηρείται μεταγραφική ενεργοποίηση
συγκεκριμένων γονιδίων, iii) των παραγόντων που
ρυθμίζουν τη μεταγραφή τους
τύπου Western (Western blotting)
στην ανίχνευση πρωτεϊνών μετά από
ηλεκτροφόρηση συνήθως σε πήκτωμα SDSπολυακρυλαμίδης, χρησιμοποιώντας ως ανιχνευτή
ένα σημασμένο αντίσωμα ειδικό προς την
επιθυμητή πρωτεΐνη.
μειονεκτηματα στυπωματος
υτά, η απουσία του διαχωρισμού των
τμημάτων DNA μέσω της ηλεκτροφόρησης στην
περίπτωση των DNA-DNA dot blots μειονεκτεί
συγκριτικά με τo Southern blot, καθώς δεν
επιτρέπει τον προσδιορισμό του μεγέθους του υπό
μελέτη τμήματος DNA, ενώ παράλληλα δεν μπορεί
να ελεγχθεί η πιθανότητα υβριδοποίησης του
ανιχνευτή σε άλλες μη ειδικές θέσεις .
Η τεχνική του στυπώματος κουκίδας υπερτερεί
έναντι των υπολοίπων τεχνικών ανάλυσης
στυπωμάτων όσον αφορά τον χρόνο και το
κόστος
