Στύπωμα Κουκκίδας Flashcards
Τεχνικές
στυπώματος
Στύπωμα κατά Southern
(Southern blot)
Στύπωμα τύπου Northern
(Northern blot)
Στύπωμα τύπου Western
(Western blot)
Στύπωμα κουκίδας (dot blot)
με ποιους τροπους μπορουν να αποδιαταχθουν οι αλυσιδες των γουοτσον και κρικ?
υψηλη θ, υψηλο πεχα, χαμηλη συγκεντρωση αλάτων
Βασικές διαφορές τεχνικών blotting
southern dna
western proteines
northern rna
stypwma ssdna mrna or proteins xwris electrophoresi se antithesi me ta alla 3
Εφαρμογές τεχνικών υβριδοποίησης
Οργάνωση γονιδίων (χαρτογράφηση, αριθμός αντιγράφων,
καθορισμός μεγέθους)
✓ Κλωνοποίηση γονιδίων από βιβλιοθήκες
✓ Ανίχνευση πολυμορφισμών (RFLPs & VNTRs στην ιατροδικαστική)
✓ Διερεύνηση γονιδιακής έκφρασης
Ανάλυση κατά Southern
βήματα
- διαχωρισμος τμηματων δνα
2.* Μεταφορά σε μεμβράνη
3.* Υβριδοποίηση
Ανίχνευση σήματος
υβριδοποίησης
Στάδια υβριδοποίησης κατά Southern
1.πεψη με περιοριστικες ενδονουκλεασες
2. Διαχωρισμός τμημάτων
DNA με ηλεκτροφόρηση
πηκτώματος αγαρόζης
3.Διαχωρισμός τμημάτων DNA βάσει μεγέθους
4.Μεταφορά DNA από το
gel σε νάυλον μεμβράνη
5.Ακινητοποίηση DNA –
αντίγραφο κατανομής
τμημάτων στο gel
6. Υβριδοποίηση
μεμβράνης με τον
ανιχνευτή
7. Ανίχνευση
σήματος
υβριδοποίησης
Ανιχνευτής
Μικρού μήκους τμήμα (25-2000 bp) DNA ή RNA
✓Συμπληρωματικό προς την αλληλουχία-στόχο
✓Σήμανση για τη διαδικασία ανίχνευσης
* Βάσει ομολογίας με αλληλουχία στόχο
✓Ομόλογος
✓Ετερόλογος
πως είναι κατασκευασμένος ένας ανιχνευτής?
Καταρχάς τρία είναι οι κύριες κατηγορίες ανιχνευτών:
1)κλωνοποιημένα τμήματα γονιδίων
2)προϊόντα PCR ενίσχυσης
3)συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια
Και στις 3 περιπτώσεις ενσωματώνονται στο δνα η ρνα ανιχνευτη dntps h ntps syzeygmena με μόρια σήμανσης ραδιενεργά ή μη ραδιενεργά
κατά τη διαδικασία της σήμανσης πραγματοποιείται η προσθήκη των σημασμένων νουκλεοτιδίων είτε κατά την παραγωγή των ανιχνευτών είτε αφού ολοκληρωθεί η παραγωγή της.
