Sistemas de secreção tipo III Flashcards
O sistema de transporte tipo III é um mecanismo utilizado por muitas bactérias Gram _______.
Negativas
O que é o injectissoma e como é estruturado?
Estrutura macromolecular que realiza o transporte de subtância do citoplasma da bactéria para o hospedeiro e é formado por:
* corpo basal: conjunto de proteínas embebidas nas membranas celulares e constituído por anéis internos (na membrana interna), pescoço (no espaço periplásmico) e anéis externos (na membrana externa)
* agulha: polimerização de uma única proteína e cujo interior é oco.
* Possui elementos citoplasmáticos como ATPases, cuja função principal não é fornecer energia para o transporte em si, mas sim para o desenrolamento das proteínas e libertação destas das chaperonas para que possam ser transportadas.
Função do translocão:
Formação de poros na membrana da célula hospedeira para permitir a entrada das proteínas efetoras.
Atenção: translocão não faz parte do injectissoma mas é libertado para o exterior a partir deste e fica no topo da agulha
3 espécies de Yersenia que são patogénicas para os humanos.
- Y. pestis - causou a peste negra
- Y. pseudotuberculosis (causa adenite mesentérica e septicaemia)
- Y. enterocolitica - causa síndromes gastrointestinais (enterite e adenite mesentérica)
O que têm em comum as 3 espécies de Yersinia?
Todas têm tropismo para os gânglios linfáticos e todas inibem a fagocitose, de modo a inibir a resposta inflamatória, através do sistema de secreção tipo III.
O que são os ysc e os yop genes da Yersinia?
- Ysc genes: 3 operões (virA, virB e virC) que codificam para a maquinaria de secreção (the injectissoma) e para a sua regulação.
- Yop genes: codificam para as proteínas efetoras
Como se promove a expressão e secreção das proteínas Yop, artificial e fisiologicamente?
Artificialmente, a 37ºC e num meio rico sem Ca2+.
Fisiologicamente, é necessário haver contacto físico entre a bactéria e a célula hospedeira eucariótica
Como se descobriu que os genes ysc codificam para a maquinaria de secreção?
Mutação em genes do operão virC levam-se à não secreção in vitro das proteínas efetoras, o que indicou que o operão codificava para a maquinaria de secreção.
Quantas Ysc proteínas são conservadas em todos os sistemas de secreção do tipo IIi?
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Como é que se estabeleceu o modelo básico de injeção de proteínas através de um injectissoma e translocão?
- Células HeLa infetadas com Y. pseudotubercolosis WT adquiriam uma forma arredondada enquanto que células HeLa crescidas com bactérias mutadas para o gene YopE mantinham o fenótipo normal → YopE funciona no interior da célula eucariótica e interfere com o citoesqueleto
- Através de estirpes com YopD mutado percebeu-se que este é necessário para a citotoxicidade de YopE, pois com a sua ausência não se verificava a citotoxicidade de YopE mesmo este estando intacto
- Por análise bioinformática, verificou-se que YopD e YopB tinham regiões hidrofóbicas.
Que hipótese se formou depois das observações em relação à maquinaria de secreção Ysc, YopE e YopD?
YopE é diretamente citotóxica, mas necessita da maquinaria de secreção Ysc e de YopD-YopB para formarem poros na membrana da célula hospedeira e possibilitarem a sua translocação.
Como se testou a hipótese?
Em Y. enterocolitica, fundiu-se a proteína adenilato ciclase (da Bordetella pertussis) ao seu gene yop e também foi introduzido um plasmídeo com os genes da maquinaria ysc → infetaram-se células eucarióticas com este mutante → proteína adenilato ciclase converte ATP em cAMP na presença da calmodulina das células eucarióticas (adenilato ciclase como proteína repórter) → lisar as células e medir os nível de cAMP
Resultados da experiência com adenilato ciclase:
Em todos os casos, observou-se que na presença da maquinaria Ysc, os níveis de cAMP aumentam significativamente, o que indicava que Ysc é necessária para a secreção dos genes yop e que este entram na célula eucariótica através do mesmo. Também se verificou em mutantes para yopB, D e N não ocorria o aumento de cAMP, pelo que estas proteínas também são necessárias para a secreção de yopE
Mas como monotorizaram a formação de poros em células nucleadas?
Incubar macrófagos com o composto BCECF que consegue atravessar membranas → dentro dos macrófagos, é clivado por esterases intracelulares tornando-se incapaz de voltar a atravessar a membrana, ficando preso. Para além disso, fica fluorescente → infetar macrófagos com Y. enterocolitica e medir a fluorescência de BCECF no supernadante
Resultados da experiência com BCECF:
- células infetadas com bactérias wild-type: não se observou a fluorescência → existem proteínas efetoras que “selam” os poros depois da injeção de modo a evitar a saída de conteúdo citoplasmático e evitar uma resposta inflamatória
- células infetadas com bactérias mutadas para 5 proteínas efetoras e para yopN ou para 6 proteínas efetoras: houve deteção quando conjugadas com B e D → yopB e D são ambos necessários para a formação do poro.
