Manipulação do citoesqueleto de actina por patogénios bacterianos (parte 1) Flashcards
Que proteína se pode utilizar para marcar os filamentos de actina?
A faloidina, um composto de fungo que se liga diretamente à actina e que pode ser modificado quimicamente para ser fuorescente
Qual das extremidades dos monómeros de actina está associada a uma maior polimerização?
Extremidade + (“barbed-end”)
Como é que o complexo Arp2/3 promove a nucleação dos filamentos de actina?
Arp2 e Arp3, proteínas do complexo, são moléculas estruturalmente semelhantes à actina (também como uma extremidade + e -). Assim, após a ligação de um NPF (nucleation promoting factor), o complexo fica ativo e vai permitir a ligação de dois monómeros de actina (através da sua extremidade -), e estes ficam muito mais estáveis do que em dímeros sozinhos, facilitando a nucleação e formação de filamentos de actina
O complexo Arp liga-se a filamentos de actina já existentes, sempre num ângulo de ____ criando uma rede de filamentos de aspeto _____________.
- 70º
- ramificado
Como é que as forminas facilitam a polimerização de filamentos?
As forminas formam um dímero que se ligam à extremidade + da actina, estabilizando-os e recrutando mais dois monômeros de actina. A formina vai “subindo” através do filamentos, de maneira a ir recrutando sempre dois monômeros. Os filamentos são não ramificados
Exemplos e funções de proteínas sequestredoras de monómeros:
- Timosina - liga-se à extremidade - dos monómeros, previndo a sua ligação à extremidade mais de outras actinas e, assim, previne a polimerizaçao
- Profilina - liga-se à extremidade + dos monómeros, deixandoa extremidade - livre para se ligar aos filamentos,aumentando a elongação.
Quer Arp2/3, quer as forminas, têm locais de ligação a ____________ para aumentar a velocidade de elongamento da actina.
Profilinas
Nas forminas, como se chamam os locais de ligação à profilina?
Formim whiskers
Como é que a dinâmica do citoesqueleto de actina é controlada?
Pela família das GTPases Rho - consoante a atividade da proteína dentro da família, temos diferentes polimerizações da actina e diferentes estruturas formadas.
Ativação de …. dá origem a ….
- Rho - fibras de stress
- Rac - Lamellipodia
- Cdc42 - filopodia
Características da Listeria monocytogenes:
- Gram +
- Facultativa (cresce no interior ou exterior de células)
- Oportunista
- Atravessa barreiras (intestinal, hematoencefálica e materno-fetal)
- Aquirida em comida contaminada
- Doenças: meningite, meningo-encefalite, gastroenterite.
O estudo da motilidade intracelular da Listeria permitiu a descoberta do papel do ….
Complexo Arp2/3 na nucleação da actina
De maneira geral, como é que a Listeria se move intracelularmente?
Após a invasão, a bactéria fica encurralada num vacúolo → destruição (lise) do vacúolo → livre no citosol → manipulação do citoesqueleto de actina da célula, criando uma cauda de actina que conforme se polimeriza “empurra” a bactéria para a frente, como uma força de propulsão → bactéria vai contra a membrana celular de forma a que penetra a membrana da célula adjacente, entrando na célula vizinha também dentro de um vacúolo
Como é que descobriu as proteínas bacterianas necessárias para a formação da caudas de actina? Qual/quais é/são?
- Mutação aleatória por transposição: transposão insere-se aleatoriamente no genoma, inativando genes aleatórios, e analisava-se os mutantes que não se conseguiam movimentar
- mutação sistemática de genes controlados pelo regulador transcripcional PrfA, que já se sabia que estava envolvido no processo e análise de fenótipo
Observou-se que ActA (proteína sobre a ação de PrfA), é necessária para a polimerização de actina e para a sua motilidade em células infetadas com Listeria.
Como é que se percebeu que ActA é a proteína bacteriana suficiente para a formação das caudas de actina?
Através da incubação de esferas revestidas com ActA-His com ovos de Xenopu e actina-rodamina (fluorescente) → ocorreu a formação das caudas de actina e a esfera moveu-se ao longo do tempo.
Que proteínas da célula hospedeira sao manipuladas pela ActA para promover a polimerização de actina?
Complexo Arp2/3
Mas como é que se percebeu que as proteínas manipuladas eram o complexo Arp2/3?
- Pela incubação de Listeria como um extrato proteico semelhante à constituição do citoesqueleto, havia formação das caudas de actina → 2. Passou-se o extrato proteíco por uma columa Q-sefarose (onde ficavam associados os componentes carregados negativamente) e o fluxo que passou pela coluna demonstrou ter atividade de polimerização de actina → 3. Passou-se esse fluxo por uma coluna de S-sefarose (onde ficaram associados os carregados positivamente) e através de adição de sal de diferentes concentrações soltaram-se diferentes frações de proteínas e testou-se a atividade de polimerização de actina de cada fração → O pico mais alto de atividade obteu-se de uma fração com 8 polipéptidos → Tentaram separar os 8 polipéptidos por cromatografia, mas perceberam que é um complexo.
Após a descoberta do complexo de 8 polipéptidos, como é que descobriram que era o complexo Arp2/3?
Através de imunohistoquímica, com anticorpos anti-Arp3 e anti-actina, que quando complexados com um anticorpo secundário conjugado com fluoróforos, consegui-se reconhecer a sua presença nas caudas de actina
Como se verificou se o complexo Arp2/3 era capaz de induzir a nucleação sozinho?
Através de um ensaio de actina-pirena que permite a análise da polimerização da actina in vitro, pois a actina G é marcada na cisteína 374 com pireno → quando actina-pireno está na forma monomérica é pouco fluorescente e quando está na forma filamentosa é muito fluorescente. Observou-se como é que a fluorescência evoluía na presença de:
* actina-pireno
* actina-pireno + Arp2/3: promovia uma polimerização mais rápida do que actina-pireno sozinha
* actina-pireno + ActA: a presença de ActA não promove a polimerização mais rápida do que a que ocorria com a actina-pireno sozinha
* actina-pireno + Arp2/3 + ActA - polimerização mais rápida do que com apenas Arp2/3 e atividade imediata de nucleação, ao contrário de apenas Arp2/3 em que demorava alguns segundos
CONCLUSÃo: ActA é um NPF - o primeiro identificado
Domínio semelhante de todos os NPFs e diferenças entre a utilização deste domínio em Listeria e Shigella
WCA: domínio de ligação a actina G e Arp2/3 (domínio presente nos NPFs WASPs) → a proteína ActA em Listeria mimetiza este domínio, funcionando ela própria como um NPF
Contrariamente, a bactéria Shigella tem uma proteína IcsA/Virg1 que ativa os N-WASPs, NPFs com domínio WCA, (mimetizando os seus ativadores), recrutando os da célula hospedeira.
Quais são os fatores proteicos adicionais necessários para a motilidade intracelular de Listeria e Shigella (que estavam presentes na coluna de Q-sefarose)?
- ADF - fator de despolimerização de actina (cofilina) → aumenta a despolimerização de actina para manter disponibilidade de actina monomérica
- CapZ (capping protein) → previne o crescimento não produtivo dos filamentos sem ser na zona da cauda
- Profilina e α-actinina → aumenta a velocidade da motilidade, mas não são essenciais
A motilidade intracelular de Listeria é independente de ________.
Miosinas
Qual é o papel do complexo Arp2/3 nos processos endogénos das células eucarióticas envolvendo a polimerização da actina?
- Migração celular e adesão: formação de protusões de lamellipodia e envolvimento na adesão de célula-matrix ou célula-célula
- Movimento de organelos e vesículas: fagocitose, endocitose e exocitose.
Porquê é que os filamentos na Rickettsia são lineares e não ramificados?
Porque a bactéria tem uma proteína que promove a polimerização linear da actina, ou seja, uma proteína que atua como forminas das células eucariotas.
Qual é a proteína da bactéria que promove a polimerização linear da actina?
Sca2
Estrutura da Sca2:
- é um autrotransportador (T5SS) que se localiza à superfície da célula bacteriana
- possui uma sequência sinal para o sistema Sec para passar a membrana interna
- domínio AT (ou beta) que se insere na membrana externa
- domínio alfa (ou passenger) que é o que está no exterior (pode ou não ser clivado)
Sca2 possivelmente mimetiza:
Forminas
A actina G está associada a ______ e a actina F está associada a ______.
- G: ATP
- F: ADP
