Manipulação do citoesqueleto de actina (parte II)

Question 1

Dois mecanismos de invasão e exemplos:

Answer 1

• Mecanismo zipper (ex: Listeria Yersinia): adesina à superfície de uma bactéria que interage com recetores da célula hospedeira, levando a um rearranjo não muito dramático da membrana plasmática através da polimerização de actina localizada → conforme isto vai ocorrendo cada vez mais adesinas se ligam a receptores e o efeito é perpetuado até a bactéria estar envolvida e entrar na célula;
• Mecanismo trigger (ex: Salmonella): interação da bactéria com o hospedeiro que secreta proteínas efetoras através do sistema de secreção tipo III, levando à polimerização da actina e a rearranjos massivos na membrana plasmática → internalização da bactéria

Question 2

Importância da invasão para células hospedeiras das bactérias durante a infeção

Answer 2

• ajuda a bactérias a escaparem da resposta imune
• replicação para bactérias intracelulares
• passagem de barreiras de defesa (tipicamente do epitélio do intestino)

Question 3

Duas espécies de Salmonella:

Answer 3

• Salmonela entérica (mais de 2000 serotipos) causam febre tifoide (infeção sistémica) e gastroenterite (infeção localizada)
• Salmonela bongori (infeta essencialmente répteis)

Question 4

Diferenças na invasão de Salmonella numa infeção localizada e sistémica:

Answer 4

• Localizada: multiplica-se intracelularmente nas células epiteliais e promove a libertação de citocinas, levando à inflamação dos intestinos
• Sistémica: bactéria migra para o fígado e baço e multiplica-se dentro de mácrofagos nesses órgãos.

Para a Salmonella causar infeção precisa de se multiplicar intracelularmente

Question 5

Invasão e replicação associado a 2 tipos de secreção do tipo III:

Answer 5

• SPI-1: ativação extracelularmente, injeção de proteínas efetoras que permitem a invasão da bactéria. Este sistema é degradado ao fim de algumas horas de infeção, altura em que SPI-2 começa a ser expresso e há formação de um vacúolo à volta da bactéria.
• SPI-2: promove a replicação intracelular

Question 6

Proteínas efetora da Salmonela que contribuem para a alteração do citoesqueleto de actina e invasão de células não fagocíticas:

Answer 6

• SopE/SopE2 - GEFs
• SopB - fosfatase inositol
• SipA - inibe a despolimerização da actina, estabilizando F-actina
• SipC - proteína translocadora que promove a nucleação da actina

Question 7

SopE, SopE2 e SopB atuam em …. e SipA e SipC atuam….

Answer 7

• moléculas que vão atuar na actina
• diretamente na actina

Question 8

SopE, SopE2 e SopB atuam em que moléculas?

Answer 8

GTPases da família Rho → SopE e SopE2 são GEFs que ativam Rho, levando que estas interajam com proteínas que modificam actina

Question 9

O que fazem as GDI?

Answer 9

Extraem as GTPases das membranas, ligando-se às mesma de forma a esconder a sua cauda lipídica, impedindo que sejam ativadas

Question 10

As GTPases apenas podem ser ativadas quando associadas a :

Answer 10

Membrana, pois é aí que existem GEFs.

Question 11

As GTPases têm atividade de hidrólise muito baixa e por isso necessitam de :

Answer 11

GAPs que estimulem a sua atividade de hidrolase, após o que perdem o grupo fosfato, voltando a estar na conformação inativa ligada a GDP.

Question 12

GTPases são alvos de dezenas de proteínas de diferentes bactérias patogénicas:

Answer 12

• Modificações covalentes irreversíveis: adição de ADP-ribose pela toxina C3 da C.botulinum, glicosilação pela toxina B de C. dificcile, proteólise pela YopT da Yersinia, podendo ativar ou inativar as GTPases Rho
• efeitos reversíveis pela mimetização: várias proteínas efetoras são GEFs que ativam Rhos ou GAPs que inibem Rhos

Question 13

Relação de SopE com Rac ou Ras (pequenas GTPases da família Rho)?

Answer 13

• depende de Rac, pois a introdução de Rac inativa (sempre ligada a GDP), impedia a ação de SopE → efeito dominante negativo
• a introdução de Ras inativa já não impedia a ação de SopE

Question 14

Conclusões tiradas pela análise da radioatividade de GDP reativo ligada a Rac mais a adição de GTP (passar depois a solução por um filtro que retem as proteínas e medir a radioatividade no filtro)?

Answer 14

1. quando se incuba Rac-GDP + GTP verifica-se que a radioatividade se mantém elevada (GDP só passa o filtro se não estiver ligado à proteína Rac, uma vez que as proteínas são demasiado grandes para passarem o filtro) → logo Rac tem dificuldade em trocar GDP por GTP
2. quando se incuba Rac-GDP + GTP + SopE a radioatividade diminui ao longo do tempo, ou seja, GDP está a ser trocado mais rapidamente por GTP e passa para o filtrado) → SopE tem atividade enzimática sobre a Rac que faz trocar GDP por GTP, logo é uma GEF.

Question 15

Na experiência da radioatividade, porquê é utilizado o EDTA?

Answer 15

É utilizado como um controlo (negativo), pois na presença de EDTA (quelante de Mg2+) a proteína Rac não se consegue ligar a nenhum nucleótido

Question 16

SopE2 é uma GEF para que GTPase?

Answer 16

Cdc42

Question 17

Evolução convergente e mimetismo estrutural entre SopE e SopE2 e GEFs dos mamíferos:

Answer 17

• Porque a sua sequência de aminoácidos não é parecida com nenhuma dos eucariotas mas os seus centros catalíticos são semelhantes aos GEFs dos mamíferos e o mecanismo de ação é idêntico
• Proteínas eucarióticas e bacterianas evoluíram independentemente mas da mesma forma

Question 18

As diferenças nos padrões de fosforilação dos fosfoinositídeos implicam diferenças no recrutamento de:

Answer 18

Proteínas para as membranas.

Question 19

O que se observou com mutantes não funcionais de SopB e qual foi a hipótese retirada daí?

Answer 19

Com o mutantes não eram induzidas deformações na actina na membrana plasmática.
Colocou-se a hipótese de que desfosforilação de fosfoinositídeos na membrana plasmática por SopB promove o recrutamento de GEFs na célula do hospedeiro.

Question 20

SopB promove a ativação de uma:

Answer 20

SGEF (GEF que ativa RhoG), através de um mecanismo desconhecido

Question 21

Ativação de Rac e RhoG através de SopE/E2 e SopB leva a:

Answer 21

Rearranjo da membrana e internalização da Salmonella por células não fagocíticas.

Question 22

O que promove a ativação de Cdc42 por SopE e SopE2?

Answer 22

• não leva a alterações no citoesqueleto de actina
• induz a expressão de citocinas (IL-8 que recruta neutrófilos)

Question 23

Vias pelas quais a Salmonella altera o citoesqueleto de actina, promovendo a sua entrada:

Answer 23

• via independente do complexo Arp2/3 (SopB ativa Rho que ativa Rho-cinase que ativam miosinas IIA/B, promovendo a internalização da bactéria sem a formação de pregas “ruffles” da membrana)
• via dependente do complexo Arp2/3 (Sop’s ativam Rac1 e RhoG que ativam NPFs (WAVE e WASH) que ativam o complexo Arp2/3)

Question 24

SipA não é essencial apenas….

Answer 24

Torna o processo mais rápido

Question 25

Função de SptP:

Answer 25

É uma GAP (troca GTP por GDP) promovendo a despolimerização de actina

Question 26

Tendo em conta que SopE e StpP têm funções opostas, porquê é que no início há predominância de SopE?

Answer 26

• Modelo 1: SopE e SptP são entregues em quantidades iguais ao mesmo tempo, mas pouco tempo depois SopE é ubiquitinado e degradado e SptP não (este modelo não explica o porquê da predominância de SopE no início já que ambos são libertados ao mesmo tempo)
• Modelo 2: SopE (e SipA) são injetadas uns segundos mais cedo do que SptP, ativando GTPases e remodelando a actina. Alguns segundos depois SptP é injetada e SopE é ubiquitinado para degradação. Assim passa a predominar SptP que reverte os rearranjos de actina pela inativação das GTPases.

Question 27

Como é que SopB é regulado?

Answer 27

SopB também é ubiquitinada, mas neste caso não é degradada, mas apenas sofre alteração na sua localização, deixando de estar associada à membrana plasmática e direcionando a formação dos vacúolos que contém Salmonella (SCV), onde irá promover a replicação da célula.

Question 28

Recetores na superfície de células hospedeiras eucarióticas envolvidas na invasão por Listeria e Yersinia:

Answer 28

• Listeria - E-caderina
• Yersinia -B1 integrinas

Question 29

Integrinas e caderinas predominam no lado ____________ da célula, mas a bactéria interage com o lado _____________.

Answer 29

• basolateral
• apical