Sequenciamento do DNA

Question 1

Quais são as aplicações do sequenciamento?

Answer 1

• Biologia molecular(estudo de genes e proteínas codificadas)
• Biologia evolutiva(relação entre organismos)
• Medicina(identificar pacientes com doenças genéticas)
• Ciência forense(análise criminal e teste de paternidade)

Question 2

O que é preciso para fazer o Método de Sanger?(5)

Answer 2

Amostra de DNA
Primers
DNAp
dNTPs
ddNTPs

Question 3

Como funciona o sequenciamento?

Answer 3

É colocado amostra de DNA+primer+dNTP+DNAp em 4 tubos, e 1 ddNTP diferente em cada tubo.
Então, quando a DNAp coloca um ddNTP na cadeia, a replicação para.

Question 4

E qual é o intuito da reação parar?

Answer 4

Saber a última base nitrogenada de milhares de fragmentos de DNA

Question 5

Como funciona o Método de Sanger automatizado?

Answer 5

O mesmo procedimento do método manual, porém com uma automatização da eletroforese, a eletroforese capilar
A eletroforese funciona assim:

Conexão com o gel, de um catodo(-) para um anodo(+), onde é colocado a solução no anodo > fornecimento de eletricidade > fragmentos + curtos = + rápidos passam primeiro por um laser que identifica os ddNTP marcados > identificação do DNA por completo ao decorrer do tempo

Question 6

Quais são as aplicações do Método de Sanger?(5)

Answer 6

• Sequenciamento de fragmentos
• Detecção de variantes e mutações
• Identificação biológica
• Confirmação de construções de clones
• CRISPR(sei q isso n)

Question 7

Vantagens do Método de Sanger?(3)

Answer 7

• Prático
• Eficaz
• Permite sequenciar 800 nucleotídeos

Question 7

Desvantagens do Método de Sanger?(2)

Answer 7

• Caro
• Demorado(para projetos de larga escala)

Question 8

Quais vantagens do NGC?(4)

Answer 8

• Melhor tecnologia de sequenciamento e métodos computacionais
• Leitura de bilhões de fragmentos simultaneamente
• Menor custo e menos tempo de análise de genoma e exoma
• Aumentam acurácia, eficiência, resolução e reprodutibilidade

Question 9

Diferenças dos NGS e Sanger?

Answer 9

• Sanger: vai até 96 fragmentos por 800 pb
• NGS: milhões até bilhões de fragmentos

Question 10

O que um NGS de 2a geração precisa?

Answer 10

• Criar uma biblioteca de dados, que pega parte do DNA e o fragmenta, adicionando adaptadores

Question 11

Quais etapas de uma NGS?(3)

Answer 11

• Amplificação(PCR)
• Sequenciamento
• Análise de dados

Question 12

Como funciona o NGS da Ilumina?

Answer 12

• Biblioteca: fragmento + adaptador > amplificação(flow cell com primers e sequenciamento complementar ao adaptador) > liga ao primer com o adaptador > 2 adaptadores se conectam e formam uma ponte > formação de um cluster de fragmentos > aplicar dNTP com marcador > emissão de sinais

Question 13

Quais são as aplicações do NGS da Ilumina?(4)

Answer 13

• Diagnóstico molecular
• Oncologia genética microbiana
• Estudo de doenças complexas e genômica
• Sequenciamento completo de um genoma ou de partes

Question 14

Quais são as vantagens da Ilumina?(3)

Answer 14

• Multiplexagem de milhares de amostras em uma única corrida
• Menor custo e taxas de erro
• Pode gerar 20 bilhões de bases sequenciadas entre 19-40 hrs

Question 15

Como funciona o NGS da Nanopore?

Answer 15

Uma proteína motora desenrola a fita de DNA na membrana do aparelho(do polo negativo ao positivo) > sequenciamento do DNA, em que cada base gera uma amplitude diferente de onda

Question 16

Quais as vantagens do Nanopore?(4)

Answer 16

• Usa um dispositivo portátil e pequeno(MiniION)
• Gera grandes quantidades de dados, com uma amostra simples
• Baixo custo
• Menor tempo de corrida(48hrs)

Question 17

Quais as aplicações do Nanopore?(3)

Answer 17

• Vigilância de patógenos
• Detecção de mutações-alvo
• Análise da metagenômica(genomas bacterianos e virais)