Semaine 8

Question 1

Expliquez ce qu’est PCR (polymerase chain reaction)

Answer 1

La PCr permet de choisir un segment d’ADN particulier dans un génome et d’amplifier cette séquence cible de manière exponentielle afin d’en obtenir des millions de copies

Question 2

Quel type de technique d’amplification est la PCR et mise au point par qui?

Answer 2

technique d’amplification ‘‘in vitro’’

mise au point par K. Mullis en 1985 (nobel prize in 1993)

Question 3

Mr K. Mullis avait besoin d’un facteur clé lors de sa mise au point du PCR, expliquez

Answer 3

facteur clé de son succès est l’utilisation de l’ADN polymerase Taq.

NB : cette enzyme est resistante à la chaleur

Question 4

Quel est l’attribut principal de l’ADN polymerase Taq?

Answer 4

enzyme résistante à la chaleur

Question 5

La polymérase Taq permet de générer…….

Answer 5

des fragments d’ADN ne dépassant pas généralement 4kb

Question 6

Que permet la complémentarité des bases? (propriétés importantes de l’ADN)

Answer 6

dénaturation/renaturation

hybridation/appariement

élongation de l’amorce (‘‘primer’’) par une ADN polymérase (5’ à 3’)

Question 7

D’ouè provient l’ADN polymérase Taq?

Answer 7

isolée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus

Question 8

Caractéristiques en lien avec la température de l’ADN polymérase Taq

Answer 8

T optimale = 72*C

résiste jusqu’à 95*C soit proche du point d’ébulition

Question 9

Expliquez brièvement les étapes de PCR

Answer 9

À chque cycle, il y a augmentation de température afin de se rapprocher du 95*C, par contre après chaque cycle, l’activité enzymatique diminue donc après de nombreux cycles, l’activité est presque nulle/faible

Cycle 1-2 : les fragments sont amplifiés et ont des longueurs indéfinies

Cycle 3 : les longueurs des fragments sont définies

Question 10

V ou F

Le nombre de copies de la séquence cible triple après chaque cycle

Answer 10

F

elle double, ne triple pas

Question 11

V ou F

La séquence cible augmente de manière exponentielle

Answer 11

V

Question 12

Comment prédire le nombre total de copies de la séquence cible (Y)

Answer 12

Y = x 2n

y = nombre final de copies
x = nombre initial de copies
n = en exposant nombre de cycles

Question 13

À quelle température se passe l’élongation, la dénaturation et l’hybridation

Answer 13

élongation = environ 72*C
permet ls synthèse d’un brin complémentaire par la Taq polymérase

Hybridation = environ 40-65*C
Fixation d’un couple d’amorce

Dénaturation = environ 95*C
Séparation des 2 brins d’ADN

Question 14

Quel outil est utilisé afin de produire les changements de température à chaque cycle

Answer 14

Thermocycleur

Question 15

Expliquez les paramètres pour la dénaturation

Answer 15

95*C pendant 30 à 60s

Question 16

expliquez les paramètres pour l,hybridation des ammorces

Answer 16

30 à 60s
40-65*C (variation en fonction de la longueur)

Température d’appariement : Tm - 5*C

Tm = température à laquelle 50% des molécules d,amorce sont associées à la matrice

La Tm d’une amorce dépend de sa longueur et de son % G+C

Question 17

Comment calculer la valeur aproximative de la Tm d’une amorce?

Answer 17

Tm = (4 * X) + (2 * Y)
Tm en *C

X = nombre de G et C
Y = nombre de A et T

4 car 4*C pour chaque guanine et cytosine

2 car 2*C pour chaque adénine et thymine

Question 18

Expliquez les paramètres pour l’élongation

Answer 18

72*C pendant 30 à 60S (en fonction de la longueur de séquence qu’on veut amplifier)

La durée dépend de la longueur de la séquence cible soit 1kb/min

Nombre total de cycles (PLUS PETIT OU ÉGAL À 30)

Question 19

Au niveau de l’élongation, que ce passe t il au delà de 20 à 25 cycles

Answer 19

enzyme est de moins en moins efficace (passages successifs à 95*C) et la réaction atteint un PLATEAU

Question 20

Au niveau de l’élongation, que ce passe t il au dernier cycle

Answer 20

Une étape d’élongation additionnelle est effectuée pour s’assurer que la synthèse de tous les brins est complète

Question 21

V ou F

Les amorces déterminent la spécificité de la PCR

Answer 21

V

Question 22

V ou F

L’amplification spécifique de la séquence comprise entre les extrémités 5’ des 2 amorces

Answer 22

V

Question 23

La longueur des amorces est un facteur critique, pourquoi?

Answer 23

L’amorce doit etre spécifique pour éviter qu’il y aille présence de trop de site d’amorcage

la longueur de 15 à 35 nucléotides
Plus l’amorce est longue plus l’hybridation est spécifique

pour le génome humain,il faut utiliser des amorces d’AU MOINS 17 BASES

Question 24

Comment calculer le nombre de séquences possibles pour un oligonucléotide?

Answer 24

4 à la n

n = combien de nucléotide de long (base)

Question 25

Lors de choix d’amorces, énumérez 2 états à éviter

Answer 25

séquence complémentaires à l’intérieur d’une même amorce (une amorce qui peut s’auto-apparier avec sa propre séquence)

Complémentarité de bases entre les 2 amorces (il ne faut pas que les extrémités puissent s’apparier)

Question 26

Énumérez quelques applications de la PCR

Answer 26

Dans le domaine médical et divers domaines de la microbiologie (santé publique, qualité de l’eau, aliments, cannabis) : déterction d’organismes pathogènes ou virus)

Analyse de l’expression de gènes spécifiques (ARNm doit être préalablement converti en ADNc): suivre le dévelopement du cancer et évaluer les effets d’un traitement

En médecine légale, identification d’individus (criminels potentiels, victimes de guerre, membres d’une même famille) par l’analyse de polymorphismes

Question 27

Expliquez en détails les polymorphismes d’ADN

Answer 27

La séquence du génome (génotype) d,une individu est similaire à celle d’un autre individu de la même espèce (similarité de 99,9% chez l’humain)

Les variations de séquenc parmi les individus d,une population sont appelées de spolymorphismes hénétiques. En moyenne, il y a une variation tous les 1000 nucléotides

Chauqe variant à un locus donné constitue un allèele. Les allèles sont hérités de façon Mendélienne

Certains allèles affectent le phénotype, cest à dire provoquent un chagement visible dans l’apparence d’un organisme ou d’une cellule

Question 28

Expliquez les différents types de polymorphismes d’ADN

Answer 28

Variation ponctuelles appelées SNP, pour single nucléotide polymorphisme : un nucléotide est remplacé par un autre

Polymorphismes de répétitions :
STR = short tandem repeat (microsatellites)
VNTR = variable number of tandem repeats (minisatellites)

Question 29

Qu’est ce que pMCT118

Answer 29

motif répété de 16 nucléotides

présence dans une région NON CODANTE

pMCT118 n’est associé à aucune maladie ni à un prédisposition (phénotypiquement neutre)

allèles contiennent généralement 14 à 41 copes du motif de I6 nucléotides

28 allèles connus

Question 30

Peut on toujours faire l’amplification e pMCT118 par PCR?

Answer 30

NON!

il y nécessaire que ça soit hétérozygote