Séance 4 Flashcards
De quoi est composé un gel SDS-PAGE?
De polyacrylamides (polymérisation de monomères d’acrylamide)
Que signifient les %T et %C?
T représente la concentration totale de monomère (acrylamide + bisacrylamide)
C, le pourcentage de monomère T totaux provenant de la bisacrylamide
Qu’est ce qui initie la polymérisation de l’acrylamide?
Les catalyseurs APS et TEMED
Comment TEMED aide-t-il?
Il augmente la production de radicaux libres de APS
Est ce qu’un grand pourcentage acrylamide est avantageux?
Non, transfert moins efficace, mais facile de manipulation
Quelle est la relation entre la mobilité relative et le logarithme du poids moléculaire de la protéine?
Inversement proportionnel
Que fait le sodium dodecyl sulfate (SDS)?
Il dénature les protéines (détergent anionique)
Qu’est ce que la méthode Laemmli?
Couler un gel de compactage sur un gel de séparation
Pourquoi ajoutons nous du glycérol et du bleu de bromophénol aux échantillons?
Glycérol = plus dense pour aller dans les puits
Bromophénol = colorer et descend vite donc base de gel
Quel colorant est utilisé pour colorer le gel et en quelle quantité?
Le bleu de Coomassie R250, 10X le volume du gel pour faire compétition au SDS lié aux protéines
Pourquoi les protéines sur le gel ne vont pas vers la solution de coloration?
Parce que l’éthanol 40%, l’acide acétique 10% et l’eau distillée 50% causent la précipitation des protéines dans le gel
Comment fonctionne le transfert sur membrane PVDF?
Sandwich, on met 2 membranes absorbantes et dans le milieu gel et PVDF. Les protéines sont chargées négativement par le SDS et migrent donc vers l’anode, sont arrêtées par la membrane et se lient par forces hydrophobes.
Qu’est-il possible de faire avec les protéines de la membrane qui n’est pas possible avec le gel?
Marquer les protéines totales ou des protéines spécifiques avec un anticorps spécifique
Qu’est ce que le Ponceau S et en quoi est-il utile?
C’est un colorant, il est utile pour faire le marquage totale des protéines et il est réversible
Comment fonctionne le NHS-Biotine?
NHS-biotine se lie aux résidus lysines ou n-terminus des polypeptides
Que fait la streptavidine couplée au peroxydase de raifort (HRP)?
La streptavidine se lie à son ligand la biotine et le HRP agit sur le substrat de la révélation
Comment peut-on décrire l’interaction Streptavidine-Biotine?
Interaction non-covalente la plus forte entre une protéine et son ligand
Que doit-on ajouter à la membrane pour être en mesure de visualiser les protéines?
Le luminol. La peroxydase va catalyser l’oxydation du luminol
Qu’est ce que la quantité de lumière émise signifie?
Elle est proportionnelle à la quantité de protéines trouvées sur la membrane
Avec quoi bloquons-nous le bruit de fond de la membrane?
Avec tu TBS-Tween-Lait, car il contient des protéines et un détergent
Quel est l’anticorps primaire utilisé?
L’antisérum de souris
Quel est l’anticorps secondaire utilisé?
Anti-Ig de souris couplé à HRP
Que faut-il ajouter après le HRP
Le luminol
