Replikacija DNA Flashcards
Što osigurava replikacija DNA?
udvostručenje, brzo i precizno kopiranje genetičkog materijala što omogućava njegovo nasljeđivanje u stanice kćeri
Kakva je replikacija DNA i eksperimentalni dokazi za to?
Herbert Taylor (1957)
• replikacija eukariotskog genoma
• autoradiografija kromosoma boba (Vicia faba)
⚫ Matthew Meselson i Franklin Stahl (1958.)
• replikacija genoma bakterije E.coli
• teški izotop dušika i centrifugiranje u gradijentu CsCl
Objasni pokus H.Taylora
autoradiografija metafaznih kromosoma u stanicama korijena boba
⚫ jedna replikacija u prisustvu radioaktivnog timidina (3H-dTTP)
⚫ ostale replikacije DNA bez prisutnosti radioaktiviteta
bakterija E. coli uzgojena na podlozi s teškim izotopm dušika (jedini izvor dušika u podlozi bio je 15NH4Cl) – “teška DNA”
uzgoj bakterije koja sadrži “tešku DNA” nastavljen u podlozi s uobičajenim izotopom dušika (14N)
izolacija DNA u vremenskim razmacima
centrifugiranje DNA u gradijentu gustoće 6M CsCl
⚫ 24 do 72 sata pri 450.000 g
⚫ nastaje gradijent gustoće CsCl (1,66 do 1,76 g/mL)
⚫ molekule DNA pozicioniraju se u području gdje je gustoća CsCl jednaka “gustoći plutanja” DNA
⚫ položaj DNA u kiveti se detektira mjerenjem apsorbancije pri 260 nm
centrifugiranje u gradijentu CsCl
Moguće razdvajanje
⚫ lake DNA i teške DNA
⚫ DNA i RNA
⚫ ssDNA i dsDNA
⚫ DNA različitog GC/AT-sastava
Objasni pokus M. Meselson i F. Stahl
uzgoj bakterija u podlozi s 15N-teška DNA
prva generacija u podlozi s 14N-teška/laka DNA(lanac normalan drugi teški)
druga generacija u podlozi s 14N-2mol.sa lakom DNA(oba lanca laka),2 teška/laka DNA(1 L teški, drugi laki)
Što je napravio A. Kornberg ?
otkrio DNA - polimerazu
Tko je odgovoran za otkriće DNA-polimeraze?
A. Kornberg
što su radili i zaključili A. Kornberg i suradnici?
izolirana prva DNA-polimeraza iz bakterije E. coli
A. Kornberg i suradnici:
⚫ na temelju prethodnih istraživanja zaključili da su preteče (prekursori) za sintezu DNA deoksiribonukleozid-5’-trifosfati
⚫ koristili radioaktivne nukleotide (dTTP) i činjenicu da se DNA može dobiti u talogu, dok slobodni nukleotidi ostaju u (otopini) supernatantu
inkubacija ekstrakta stanica E. coli i dNTP (32P- ili 14C-dTTP)
⚫ radioaktivni talog
⚫ pročišćavanje enzima
⚫ DNA-polimeraza (DNA-polimeraza I)
• za pripremu 500 mg čistog enzima bilo je potrebno ~100 kg stanica
⚫ detaljna biokemijska analiza
Objasni građu, ulogu i kako radi DNA- polimeraza I )
sadrži jedan polpeptidni lanac molekulske mase 103 kDa
za sintezu DNA zahtjeva
⚫ sva četiri deoksiribinukleozid-5’-trifosfata – dATP, dTTP, dCTP, dGTP (dNTP)
⚫ Mg2+
⚫ „kalup” (jednolančana DNA) i klicu sa slobodnom 3’-OH skupinom
ili
⚫ dvolančanu DNA koja sadrži jednolančane lomove (slobodnu 3’-OH skupinu)
sintetizira DNA u smjeru 5’-3’
⚫ produljuje 3’-kraj
⚫ nukleofilni napad 3’-OH skupine (na 3’-kraju klice) na α-atom fosfora deoksiribonukleozid trifosfata
brzina sinteze – 10 nt/s
Navedi i pojasni enzimske aktivnosti DNA-polimeraze I .
5’-3’ polimerazna aktivnost (kalup, klica, dNTP, Mg2+)
3’-5’ egzonukleazna aktivnost
lektorirajuća (proofreading) aktivnost
⚫ stimulirana krivo sparenim
nukleotidom na 3’-kraju
5’-3’ egzonukleazna aktivnost
⚫ na jednolančanim lomovima u dvolančanoj DNA
⚫ stimulirana 5’-3’ polimeraznom aktivnošću
što su napravili Paulo de Lucia i ]. Cairns
izolirali mutanta E. coli čiji je ekstrakt stanica pokazivao samo 0,5 do 1% polimerazne aktivnosti DNA-polimeraze I
• nazvan polA 1
• ima isto generacijsko vrijeme kao i divlji tip (!?) ali puno osjetljiviji na djelovanje mutagena
• DNA-polimeraza I odgovorna je za popravak DNA, a za replikaciju DNA odgovoran je neki drugi enzim
• DNA-polimeraza I nije “replikaza”
Objasni DNA pol. II. i III.
kao i DNA-polimerazi I, potrebna im je klica s 3’-OH te imaju 5’-3’ polimeraznu i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost
• nemaju 5’-3’ egzonukleaznu aktivnost
Tko je izolirao mutanta E. coli čiji je ekstrakt stanica pokazivao samo 0,5 do 1% polimerazne aktivnosti DNA-polimeraze I
Paula De Lucia i J. Cairns
Tko je otkrio da DNA- polimeraza nije odgovorna za replikaciju DNA?
Paula De Lucia i J.Cairns
što su napravili R. i T.Okazaki, K. Sakabe i T. Ogawa
iz bakterije E.coli izolirali kratke jednolančane fragmente DNA (Okazakijevi fragmenti)
do 1960-ih godina smatralo se da se DNA polimerizira kontinuirano u oba smjera (5’-3’ i 3’-5’)
⚫ DNA se ne sintetizira u smjeru 3’-5’
⚫ inaktivacija DNA-ligaze rezultira većom količinom Okazakijevih fragmenata
Tko je otkrio da se DNA sintetizira u smjeru 3’-5’?
R. i T. Okazaki, K. Sakabe i T. Ogawa
Kako teče sinteza lanaca DNA?
DNA-polimeraza sintetizira DNA u smjeru 5’-3’ (produljuje 3’-kraj)
komplementarni lanci DNA su antiparalelni
sinteza jednog lanca je kontinuirana (vodeći lanac), a drugog diskontinuirana (kasneći, tromi lanac) – Okazaki fragmenti
vodeći lanac – potrebna je sinteza samo jedne klice
kasneći lanac – klica je potrebna za sintezu
svakog Okazaki fragmenta
Kada su potrebne kIice pri replikaciji DNA?
vodeći lanac – potrebna je sinteza samo jedne klice
kasneći lanac – klica je potrebna za sintezu svakog Okazaki fragmenta
koji enzimi sudjeluju u sintezi kasnećeg lanca DNA i što rade ?
u sintezi kasnećeg lanca sudjeluju:
⚫ primaza (RNA-polimeraza)
⚫ DNA-polimeraza I
⚫ DNA polimeraza III
⚫ DNA-ligaza
1 – primaza sintetizira RNA-klicu
(10-12 nt)
2 – DNA-pol III sintetizira Okazaki
fragmente (E. coli: 1000-2000 nt;
eukarioti: ~200 nt)
3 – DNA-pol I degradira RNA i
sintetizira DNA (RNA se
zamjenjuje s DNA)
4 – DNA-ligaza povezuje (ligira)
Okazaki fragmente
Što radi RNA - polimeraza?
primaza sintetizira RNA-klicu
(10-12 nt)
što radi DNA-polimeraza I
DNA-pol I degradira RNA i sintetizira DNA (RNA se
zamjenjuje s DNA)
Što radi DNA polimeraza III
DNA-pol III sintetizira Okazaki fragmente (E. coli: 1000-2000 nt; eukarioti: ~200 nt)
Što radi DNA-ligaza?
DNA-ligaza povezuje (ligira) Okazaki fragmente
Kakva je replikacija DNA
bidirekcionalna
zašto je bitno razdvajaje komplementarnih lanaca i što to omogućuje?
komplementarni lanci kalupa moraju se razdvojiti kako bi se mogli spariti s deoksiribonukleotid trifosfatima
razdvajanje lanaca omogućuju:
⚫ DNA-helikaza
• kreće se u smjeru 5’-3’ po kasnećem lancu, heksamerni protein
• može odmotati 1000 pb/s, potrebna hidroliza ATP-a
⚫ protein SSB (“single-strand DNA-binding”) – tetramer, 74 kDa
• sprječavaju sparivanje baza i formiranje strukture ukosnice
⚫ topoizomeraze (giraza)
građa i uloga primaze
primaza (protein DnaG)
⚫ kodirana genom dnaG
⚫ jedan polipeptidni lanac (60 kDa)
⚫ sintetizira RNA-klicu (10-12 nt)
građa i uloga helikaze
helikaza (protein DnaB)
⚫ kodirana genom dnaB
⚫ razdvaja komplementarne lance dvolančane DNA
⚫ interakcijom s primazom osigurava inicijaciju sinteze Okazaki fragmenata
građa DNA-polimeraze III holoenzima
sastoji se od 10 različitih proteina (900 kDa) – ukupno 17 polipeptidnih lanaca organiziranih u 4 različita kompleksa
⚫ dvije srži enzima sinteza DNA (polimeraza)
⚫ dva β-kompleksa (“clamp”)
• procesivnost polimeraze
⚫ γ-kompleks (“clamp loader”)
• postavlja “clamp” na DNA
⚫ τ-kompleks (dimerizacijski kompleks)
• povezuje dvije srži enzima
četiri različita kompleksa
⚫ katalitička srž (srž enzima)
• sastoji se od 3 podjedinice (polipeptida)
• α – polimerazna aktivnost (5’-3’)
• ε – lektorirajuća aktivnost (egzo-3’-5’)
• θ – stimulira egzonukleaznu aktivnost
⚫ dimerizacijski kompleks (τ-kompleks)
• sastoji se od dvije τ-podjedinice
• povezuje dvije katalitičke srži
⚫ β-kompleks (β-dimer) – “clamp” (obujmica, prsten)
• odgovoran za procesivnost katalitičke srži
• drži katalitičku srž na DNA-kalupu
• sastoji se od dvije β-podjedinice koje tvore prstenastu strukturu oko DNA
⚫ γ-kompleks – “clamp loader” – sastoji se od 5 polipeptidnih lanaca
• postavlja β-dimer (“clamp” na DNA-kalup)
jedna srž enzima sintetizira vodeći, a druga kasneći lanac
γ-kompleks (“clamp loader”)
⚫ povezan je s srži koja sintetizira kasneći lanac
⚫ postavlja β-dimer (“clamp”) – omogućava asocijaciju srži enzima s DNA-kalupom (vodeći i kasneći lanac)
⚫ skida β-dimer – omogućava disocijaciju srži enzima sa DNA-kalupa pri završetku sinteze Okazaki fragmenta (kasneći lanac)
za α-podjedinicu (130 kDa) kodira gen dnaE
za ε-podjedinicu kodira gen dnaQ
⚫ mutacija u genu dnaQ
• smanjena preciznost replikacije za oko 1000
• stanica je mutator (ima mutator fenotip)
objasni β-kompleks DNA-polimeraze III holoenzima
dva β-kompleksa (“clamp”)
• procesivnost polimeraze
“clamp” (obujmica, prsten)
• odgovoran za procesivnost katalitičke srži
• drži katalitičku srž na DNA-kalupu
• sastoji se od dvije β-podjedinice koje tvore prstenastu strukturu oko DNA
Objasni γ-kompleks DNA-polimeraze III holoenzima
γ-kompleks – “clamp loader” – sastoji se od 5 polipeptidnih lanaca
• postavlja β-dimer (“clamp” na DNA-kalup)
povezan je s srži koja sintetizira kasneći lanac
⚫ postavlja β-dimer (“clamp”) – omogućava asocijaciju srži enzima s DNA-kalupom (vodeći i kasneći lanac)
⚫ skida β-dimer – omogućava disocijaciju srži enzima sa DNA-kalupa pri završetku sinteze Okazaki fragmenta (kasneći lanac)
objasni τ-kompleks DNA-polimeraze III holoenzima
dimerizacijski kompleks (τ-kompleks)
• sastoji se od dvije τ-podjedinice
• povezuje dvije katalitičke srži
Objasni srž enzima
kataliticka srž
sastoji se od 3 podjedinice (polipeptida)
• α – polimerazna aktivnost (5’-3’)
za α-podjedinicu (130 kDa) kodira gen dnaE
• ε – lektorirajuća aktivnost (egzo-3’-5’)
za ε-podjedinicu kodira gen dnaQ
mutacija u genu dnaQ
• smanjena preciznost replikacije za oko 1000
• stanica je mutator (ima mutator fenotip)
• θ – stimulira egzonukleaznu aktivnost
koji gen kodira za α-podjedinicu
dnaE
koji gen kodira za ε-podjedinicu
dnaQ
Pojasni replikaciju DNA – bakterije E. coli , uvjeti pocetka i vrijeme
genom E. coli je kružna molekula DNA koja ima
jedno ishodište replikacije
replikacija započinje na ishodištu replikacije oriC
replikacijske vilice kreću se (500-1000 pb/s) u
suprotnim smjerovima
brzina replikacije: ~50 kb/min (eukarioti 2 do 3 kb/min)
brzina transkripcije: ~2,4 kb/min
za replikaciju cijelog genoma potrebno ~40 minuta, ali u idealnom uvjetima generacijsko vrijeme E. coli može biti i kraće od 20 min
u idealnim uvjetima replikacija započinje svakih 20ak minuta, a to je regulirano metilacijom DNA u sekvenciji GATC (metilaza Dam)
⚫ ishodište repikacije oriC sadrži 11 GATC-sekvencija
⚫ metilacija kasni za replikacijom; replikacija može započeti samo ako je ishodište metilirano (na hemimetiliranom ishodištu vezan je protein koji onemogućava inicijaciju replikacije)
Objasni inicijaciju replikacije DNA – E. coli
ishodište replikacije – sekvencija oriC
⚫ duljina - najmanje 254 pb
⚫ sadrži dvije AT-bogate regije (jedna je duga 9, a druga 13 pb)
• 9 pb (ponovljena 4 puta) – TTATNCANA
• 13 pb (ponovljena 3 puta – GATCTNTTNTTTT
13##13###13####9################9###9###9
potrebno šest različitih proteina (prije vezanja primaze DnaG)
⚫ DnaA (20 do 40 molekula) – potreban samo za inicijaciju
⚫ helikaza DnaB, DnaC, HU, giraza i SSB
⚫ razdavjanje do 60 pb – vezanje primaze koja sintetizira RNA-klicu
molekule DnaA najprije se vežu na sekvencije duljine 9 pb, a zatim stupaju u interakciju i sa sekvencijama duljine 13 pb
⚫ DNA se savija u obliku omče (savijanje DNA
potpomaže protein HU)
vezanje dva kompleksa helikaze DnaB i DnaC
⚫ po jedan za svaku replikacijsku vilicu
⚫ DnaC postavlja helikazu DnaB na jednolančanu
DNA (kalupi kasnećih lanaca)
helikaza počinje razdvajati lance
vezanje primaze DnaG koja sintetizira RNA-klicu
na vodećem i kasnećem lancu
struktura promjera ~6 nm (480 kDa)
koje su osnovne komponente neophodne za replikaciju genoma E. coli
inicijacija na ishodištu oriC
⚫ primosom - DnaA, DnaB, DnaC, HU, giraza, SSB
DNA-polimeraze
⚫ DNA-polimeraza III holoenzim
⚫ DNA-polimeraza I
RNA-polimeraza
⚫ primaza DnaG
protein SSB
DNA-ligaza (+NAD)
za replikaciju genoma E. coli potrebno je više od 20 različitih proteina
objasni terminaciju replikacije genoma bakterije E. coli
na ter-sekvencije se veže protein Tus (antihelikazna
aktivnost)
obzirom na orjentaciju ter-sekvencije, protein Tus
zaustavlja replikacijsku vilicu koja mu prilazi s jedne
ili s druge strane
Objasni replikaciju kromosoma u eukariota
bidirekcionalna (kao i u prokariota)
kromosomi eukariota su linearne molekule DNA
⚫ replikacija krajeva kromosoma (telomeraza i telomere)
DNA eukariota je kromatinizirana (histoni)
replikacija DNA događa se samo u jednoj fazi staničnog ciklusa
⚫ brzina replikacije: do 50 pb/s (više od 10 puta sporije nego u E. coli)
⚫ genomi eukariota su veći od genoma prokariota
prosječni kromosom čovjeka
⚫ 150.000.000 pb (genom E. coli: 4.700.000)
⚫ replikacija ovog kromosoma s jednog ishodišta replikacije trajala bi 3∙106 s (~830 sati; ~35 dana)
⚫ u genomu eukariota ima više ishodišta replikacije (S. cerevisiae: ~400; H. Sapiens: ~10.000) koja su udaljena 30 do 250 kb
puno složenija regulacija inicijacije replikacije
veći broj proteina
još uvijek ima puno nepoznanica
inicijacija
⚫ DNA-polimeraza α i primaza
elongacija
⚫ vodeći lanac: DNA-polimeraza δ
⚫ kasneći lanac: DNA-polimeraza δ ili DNA-polimeraza ε
mitohondrij
⚫ replikacija i popravak DNA: DNA-polimeraza γ
Objasni metiIaciju DNA bakterije E. coli
u “staroj” DNA sve GATC-sekvencije su metilirane (N6-metiladenin)
nakon replikacije DNA je hemimetilirana jer novosintetizirani lanac nije metiliran
hemimetilirana DNA je supstrat za protein Dam (metilaza kodirana genom dam) koja metilira adenin u nemetiliranom lancu
metilacija GATC-sekvencija kasni za replikacijom oko 13 minuta
mutanti dam imaju fenotip mutatora (povećana učestalost mutacija)
Pojasni MMR-sustav bakterije E. coli
MMR (“mismatch repair”) - sustav za popravak nesparenih i krivo sparenih baza
osnovni proteini MMR-sustava E. coli
⚫ MutS i MutL
• prepoznavanje nesparenih i krivo sparenih baza
⚫ MutH
• prepoznavanje i zasjecanje hemimetilirane GATC-sekvencije
⚫ UvrD, SSB, egzonukleaze, DNA-polimeraza III, DNA-ligaza
metilacija usmjerava popravak čak i ako je sekvencija GATC udaljena i više od 1 kb – popravak prema metiliranom (“starom”) lancu
protein MutS se veže na krivo spareni par baza
na protein MutS veže se protein MutL
kompleks MutS-MutL translocira se do sekvencije GATC i veže se
protein MutH – nastaje omča
protein MutH cijepa nemetilirani lanac u sekvenciji GATC
⚫ nastaje jednolančani lom
nemetilirani lanac se degradira u smjeru od jednolančanog loma do
krivo sparenog para baza (uključujući i krivo sparenu bazu)
⚫ helikaza UvrD (ATP) i protein SSB
• 5’-3’ – Exo VII ili RecJ
• 3’-5’ – Exo I, Exo VII ili Exo X
resinteza nemetiliranog lanca – DNA-polimeraza III
stvaranje fosfodiesterske veze – DNA-ligaza (NAD+
)
