Replikacija DNA Flashcards

Question

građa i uloga primaze

Answer 1

primaza (protein DnaG) ⚫ kodirana genom dnaG ⚫ jedan polipeptidni lanac (60 kDa) ⚫ sintetizira RNA-klicu (10-12 nt)

Answer 2

helikaza (protein DnaB) ⚫ kodirana genom dnaB ⚫ razdvaja komplementarne lance dvolančane DNA ⚫ interakcijom s primazom osigurava inicijaciju sinteze Okazaki fragmenata

Answer 3

sastoji se od 10 različitih proteina (900 kDa) – ukupno 17 polipeptidnih lanaca organiziranih u 4 različita kompleksa ⚫ dvije srži enzima sinteza DNA (polimeraza) ⚫ dva β-kompleksa (“clamp”) • procesivnost polimeraze ⚫ γ-kompleks (“clamp loader”) • postavlja “clamp” na DNA ⚫ τ-kompleks (dimerizacijski kompleks) • povezuje dvije srži enzima četiri različita kompleksa ⚫ katalitička srž (srž enzima) • sastoji se od 3 podjedinice (polipeptida) • α – polimerazna aktivnost (5’-3’) • ε – lektorirajuća aktivnost (egzo-3’-5’) • θ – stimulira egzonukleaznu aktivnost ⚫ dimerizacijski kompleks (τ-kompleks) • sastoji se od dvije τ-podjedinice • povezuje dvije katalitičke srži ⚫ β-kompleks (β-dimer) – “clamp” (obujmica, prsten) • odgovoran za procesivnost katalitičke srži • drži katalitičku srž na DNA-kalupu • sastoji se od dvije β-podjedinice koje tvore prstenastu strukturu oko DNA ⚫ γ-kompleks – “clamp loader” – sastoji se od 5 polipeptidnih lanaca • postavlja β-dimer (“clamp” na DNA-kalup) jedna srž enzima sintetizira vodeći, a druga kasneći lanac  γ-kompleks (“clamp loader”) ⚫ povezan je s srži koja sintetizira kasneći lanac ⚫ postavlja β-dimer (“clamp”) – omogućava asocijaciju srži enzima s DNA-kalupom (vodeći i kasneći lanac) ⚫ skida β-dimer – omogućava disocijaciju srži enzima sa DNA-kalupa pri završetku sinteze Okazaki fragmenta (kasneći lanac)  za α-podjedinicu (130 kDa) kodira gen dnaE  za ε-podjedinicu kodira gen dnaQ ⚫ mutacija u genu dnaQ • smanjena preciznost replikacije za oko 1000 • stanica je mutator (ima mutator fenotip)

Answer 4

dva β-kompleksa (“clamp”) • procesivnost polimeraze “clamp” (obujmica, prsten) • odgovoran za procesivnost katalitičke srži • drži katalitičku srž na DNA-kalupu • sastoji se od dvije β-podjedinice koje tvore prstenastu strukturu oko DNA

Answer 5

γ-kompleks – “clamp loader” – sastoji se od 5 polipeptidnih lanaca • postavlja β-dimer (“clamp” na DNA-kalup) povezan je s srži koja sintetizira kasneći lanac ⚫ postavlja β-dimer (“clamp”) – omogućava asocijaciju srži enzima s DNA-kalupom (vodeći i kasneći lanac) ⚫ skida β-dimer – omogućava disocijaciju srži enzima sa DNA-kalupa pri završetku sinteze Okazaki fragmenta (kasneći lanac)

Answer 6

dimerizacijski kompleks (τ-kompleks) • sastoji se od dvije τ-podjedinice • povezuje dvije katalitičke srži

Answer 7

kataliticka srž sastoji se od 3 podjedinice (polipeptida) • α – polimerazna aktivnost (5’-3’) za α-podjedinicu (130 kDa) kodira gen dnaE • ε – lektorirajuća aktivnost (egzo-3’-5’) za ε-podjedinicu kodira gen dnaQ mutacija u genu dnaQ • smanjena preciznost replikacije za oko 1000 • stanica je mutator (ima mutator fenotip) • θ – stimulira egzonukleaznu aktivnost

Answer 8

genom E. coli je kružna molekula DNA koja ima jedno ishodište replikacije  replikacija započinje na ishodištu replikacije oriC  replikacijske vilice kreću se (500-1000 pb/s) u suprotnim smjerovima brzina replikacije: ~50 kb/min (eukarioti 2 do 3 kb/min)  brzina transkripcije: ~2,4 kb/min  za replikaciju cijelog genoma potrebno ~40 minuta, ali u idealnom uvjetima generacijsko vrijeme E. coli može biti i kraće od 20 min  u idealnim uvjetima replikacija započinje svakih 20ak minuta, a to je regulirano metilacijom DNA u sekvenciji GATC (metilaza Dam) ⚫ ishodište repikacije oriC sadrži 11 GATC-sekvencija ⚫ metilacija kasni za replikacijom; replikacija može započeti samo ako je ishodište metilirano (na hemimetiliranom ishodištu vezan je protein koji onemogućava inicijaciju replikacije)

Answer 9

ishodište replikacije – sekvencija oriC ⚫ duljina - najmanje 254 pb ⚫ sadrži dvije AT-bogate regije (jedna je duga 9, a druga 13 pb) • 9 pb (ponovljena 4 puta) – TTATNCANA • 13 pb (ponovljena 3 puta – GATCTNTTNTTTT 13##13###13####9################9###9###9  potrebno šest različitih proteina (prije vezanja primaze DnaG) ⚫ DnaA (20 do 40 molekula) – potreban samo za inicijaciju ⚫ helikaza DnaB, DnaC, HU, giraza i SSB ⚫ razdavjanje do 60 pb – vezanje primaze koja sintetizira RNA-klicu molekule DnaA najprije se vežu na sekvencije duljine 9 pb, a zatim stupaju u interakciju i sa sekvencijama duljine 13 pb ⚫ DNA se savija u obliku omče (savijanje DNA potpomaže protein HU)  vezanje dva kompleksa helikaze DnaB i DnaC ⚫ po jedan za svaku replikacijsku vilicu ⚫ DnaC postavlja helikazu DnaB na jednolančanu DNA (kalupi kasnećih lanaca)  helikaza počinje razdvajati lance  vezanje primaze DnaG koja sintetizira RNA-klicu na vodećem i kasnećem lancu  struktura promjera ~6 nm (480 kDa)

Answer 10

 inicijacija na ishodištu oriC ⚫ primosom - DnaA, DnaB, DnaC, HU, giraza, SSB  DNA-polimeraze ⚫ DNA-polimeraza III holoenzim ⚫ DNA-polimeraza I  RNA-polimeraza ⚫ primaza DnaG  protein SSB  DNA-ligaza (+NAD)  za replikaciju genoma E. coli potrebno je više od 20 različitih proteina

Answer 11

na ter-sekvencije se veže protein Tus (antihelikazna aktivnost)  obzirom na orjentaciju ter-sekvencije, protein Tus zaustavlja replikacijsku vilicu koja mu prilazi s jedne ili s druge strane

Answer 12

bidirekcionalna (kao i u prokariota)  kromosomi eukariota su linearne molekule DNA ⚫ replikacija krajeva kromosoma (telomeraza i telomere)  DNA eukariota je kromatinizirana (histoni)  replikacija DNA događa se samo u jednoj fazi staničnog ciklusa ⚫ brzina replikacije: do 50 pb/s (više od 10 puta sporije nego u E. coli) ⚫ genomi eukariota su veći od genoma prokariota  prosječni kromosom čovjeka ⚫ 150.000.000 pb (genom E. coli: 4.700.000) ⚫ replikacija ovog kromosoma s jednog ishodišta replikacije trajala bi 3∙106 s (~830 sati; ~35 dana) ⚫ u genomu eukariota ima više ishodišta replikacije (S. cerevisiae: ~400; H. Sapiens: ~10.000) koja su udaljena 30 do 250 kb puno složenija regulacija inicijacije replikacije  veći broj proteina  još uvijek ima puno nepoznanica  inicijacija ⚫ DNA-polimeraza α i primaza  elongacija ⚫ vodeći lanac: DNA-polimeraza δ ⚫ kasneći lanac: DNA-polimeraza δ ili DNA-polimeraza ε  mitohondrij ⚫ replikacija i popravak DNA: DNA-polimeraza γ

Answer 13

 u “staroj” DNA sve GATC-sekvencije su metilirane (N6-metiladenin)  nakon replikacije DNA je hemimetilirana jer novosintetizirani lanac nije metiliran  hemimetilirana DNA je supstrat za protein Dam (metilaza kodirana genom dam) koja metilira adenin u nemetiliranom lancu metilacija GATC-sekvencija kasni za replikacijom oko 13 minuta  mutanti dam imaju fenotip mutatora (povećana učestalost mutacija)

Answer 14

 MMR (“mismatch repair”) - sustav za popravak nesparenih i krivo sparenih baza  osnovni proteini MMR-sustava E. coli ⚫ MutS i MutL • prepoznavanje nesparenih i krivo sparenih baza ⚫ MutH • prepoznavanje i zasjecanje hemimetilirane GATC-sekvencije ⚫ UvrD, SSB, egzonukleaze, DNA-polimeraza III, DNA-ligaza  metilacija usmjerava popravak čak i ako je sekvencija GATC udaljena i više od 1 kb – popravak prema metiliranom (“starom”) lancu protein MutS se veže na krivo spareni par baza  na protein MutS veže se protein MutL  kompleks MutS-MutL translocira se do sekvencije GATC i veže se protein MutH – nastaje omča  protein MutH cijepa nemetilirani lanac u sekvenciji GATC ⚫ nastaje jednolančani lom  nemetilirani lanac se degradira u smjeru od jednolančanog loma do krivo sparenog para baza (uključujući i krivo sparenu bazu) ⚫ helikaza UvrD (ATP) i protein SSB • 5’-3’ – Exo VII ili RecJ • 3’-5’ – Exo I, Exo VII ili Exo X  resinteza nemetiliranog lanca – DNA-polimeraza III  stvaranje fosfodiesterske veze – DNA-ligaza (NAD+ )