Geni, transkripcija i translacija

Question 1

Tko je dao molekularnu definiciju gena?

Answer 1

Benzer

Question 2

(Životni) ciklus bakteriofaga T4 - litički

Answer 2

1. Infektivni bakteriofag T4
2. vezanje faga na površinu stanice i
   ispuštanje DNA
3. Sinteza mRNA faga i promjena
   specifičnosti vezanja RNApolimeraze
   E.coli za promotor.
   Sinteza enzima faga uključujući
   nukleaze koje razgrađuju genom
   E.coli. (3 min)
4. Replikacija DNA faga.
5. Nastavlja se replikacija DNA faga i
   pojava proteina faga. (15 min)
6. Pakiranje DNA u glave i sklapanje
   repova faga te početak sinteze
   lizozima.
7. Liza stanice i oslobađanje 100 do
   300 novih virusnih čestica. (22 min)

Question 3

Što je titar bakteriofaga?

Answer 3

broj infektivnih faga (u 1 mL suspenzie bakteriofaga)

Question 4

Kako se određuje titar faga?

Answer 4

Pripremi se suspenzija E. Coli i razrijeđena suspenzija faga koje se sa otopljenim mekim agrom stavljaju na krutu hranjivu podlogu.
1 plak (bistra zona) = jedan infektivni fag
Titar faga (mL-1)= broj plakova× 10 ^ (br. dec razrjeđenja)× V uzorka

Question 5

Koliko infektivnih čestica ima u 1 mL suspenzije faga ako se na podlozi, na koju
je stavljeno 5. decimalno razrjeđenje suspenzije faga, pojavilo 147 plakova?

Answer 5

Za izračunavanje treba uzeti u obzir:
• broj nastalih plakova – 147
• decimalno razrjeđenje suspenzije faga – 5. decimalno razrjeđenje
• Volumen decimalnog razrjeđenja – 0,1 mL
 Titar faga (mL-1)
= 147 x 105
(zbog decimalnog razrjeđenja) x 10 (zbog volumena decimalnig razrjeđenja)
= 1,47 x 108
•

Question 6

Benzer - cis-trans test i sojevi

Answer 6

Različiti mutanti faga T4 formiraju različite plakove na različitim sojevima bakterije E.coli
Detektirani r mutanti koji daju velike plakove na soju B
⚫ Podijeljeni u 3 grupe (rI, rII i rIII)
⚫ Mutanti rII uopće ne liziraju soj K i ne nastaju infektivni fagi
• Uvjetni (kondicionalni) mutanti
• B i S su permisivni domaćini
• K je restriktivni domaćin
 Benzer tijekom 10 godina proizveo, izolirao i pohranio preko 3000 rII
mutanata te ih koristio u testu komplementacije (cis-trans test)
POKUS:
soj K istovremeno inficirao sa po dva različita rII mutanta (ne liziraju soj K)
⚫ neke kombinacije ne liziraju soj K – nema komplementacije mutacije
⚫ neke kombinacije liziraju soj K – komplementacija mutacije
⚫ temeljem rezultata, svi mutanti svrstani u dvije skupine (A i B) -Svrstani u dvije grupe (rIIA i rIIB) jer je fenotip ovih mutanata posljedica inaktivacije jednog ili dva gena (A i B)
⚫ dva mutanta iz različitih skupina (trans) liziraju soj K
• komplementacija mutacija
⚫ dva mutanta iz iste skupine (cis) ne liziraju soj K
• nema komplementacije mutacija
sve mutacije u genomu koje se ne mogu međusobno
komplementirati definiraju jedan cistron (nalaze se u cis)
Ovo je primjer uobičajene intergenske komplementacije („nadopunjavnje”,
„poništavanje posljedica postojanja mutacije”), a kasnije je otkriveno da je u
nekim slučajevima moguća i intragenska komplementacija

Question 7

što je gen

Answer 7

Gen – Niz nukleotida koji nosi informaciju za protein ili funkcionalnu molekulu RNA (mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, miRNA, . . .) uključujući i cis-djelujuće regulatorne nizove nukleotida (operator, promotor, terminator. U eukariota uključuje egzone i introne.

Question 8

Što je ORF?

Answer 8

ORF („Open Reading Frame”) – Otvoreni okvir čitanja – niz nukleotida koji kodiraju za neki protein, uključujući start i stop kodone. U eukariota je, prije procesiranja u hnRNA, ORF prekinut intronima.

Question 9

Što su aleli?

Answer 9

Alternative, inačice, varijante jednog te istog gena – razlikuju se u redoslijedu nukleotida. Neki gen može imati više aktivnih(funkcionalnih) i neaktivnih (nefunkcionalnih) alela. Divlji tip alela je najčešće funkcionalan i onaj koji dominira u prirodnim populacijama.

Question 10

što su divlji tipovi organizma ,stanica i virusa?

Answer 10

Oni koji dominiraju u prirodnim
populacijama te sadrže divlje tipove gena/alela

Question 11

Što je genom?

Answer 11

Ukupni, kodirajući i nekodirajući, nasljedni (genetički)
materijal organiziran na odgovarajući način. Uključuje kromosomski (kromosomi u jezgri, nukleoid u bakterijama) i izvankromosomski genetički materijal (plazmidi, genetički materijal u organelima).

Question 12

Što je lokus

Answer 12

Točno određeno fizičko mjesto na kromosomu. Može
označavati mjesto na kojem se uobičajeno nalazi neki gen, ali se metodama genetičkog inženjerstva neki lokus može modificirati (promijeniti) pa se tako primjerice u lokusu URA3 može nalaziti gen
LEU2.

Question 13

Funkcionalni gen što je

Answer 13

– gen koji kodira za protein ili funkcionalnu RNA

Question 14

što je aktivni gen?

Answer 14

Aktivni gen – gen koji se eksprimira
⚫ Događa se transkripcija
⚫ Nastaje aktivni protein na točno određenom mjestu u stanici ili izvan nje

Question 15

Zajedničke karakteristike transkripcije u prokariota i eukariota?

Answer 15

• RNA-polimeraza sintetizira RNA prema DNA kao kalupu
• nekodirajući lanac DNA (kalup) komplementaran je
novosintetiziranoj RNA
• kodirajući lanac DNA „identičan” je novosintetiziranoj RNA
(RNA umjesto T sadrži U)
• RNA-polimeraza sintetizira RNA produljujući njen 3’-kraj (novi nukleotidi se vežu na 3’-kraj), a pri tome RNA-polimeraza, po nekodirajućem lancu napreduje, u smjeru 3’-5’

Question 16

Zajedničke karakteristike translacije prokariota i eukariota

Answer 16

ribosomi po mRNA napreduju u smjeru 5’-3’, a polipeptidni
lanac raste vezanjem aminokiselina na C-kraj

Question 17

Razlika prijenosa informacija između prokariota i eukariota

Answer 17

Prokarioti
• transkripcijom nastaje „zrela” mRNA prema kojoj se sintetizira polipeptidni lanac
• translacija može započeti na mRNA koja još nije potpuno sintetizirana (transkripcija i translacija nisu prostorno i vremenski odijeljeni procesi)
• većina gena prokariota organizirani su u operone čijom transkripcijom nastaje
policistronska mRNA – nosi informaciju za više različitih polipeptidnih lanaca
(sadrži više ORFova)
⚫ Eukarioti
• transkripcijom nastaje pre-mRNA (prkursor-RNA), primarni transkript tj. hnRNA
(heterogena nuklearna RNA – sastoji se od introna i egzona) koja se procesira (uklanjanje introna i dodavanje „kape” na 5’-kraj i poli-A na 3’-kraj)
• procesiranjem hnRNA nastaje „zrela” mRNA koja se transportira u citoplazmu te sudjeluje u procesu translacije
• transkripcija i translacija prostorno su i vremenski odijeljene
• imaju monocistronsku mRNA – jedna mRNA sadrži samo jedan ORF

Question 18

Kako se procesira pre- mRNA eukariota ? - što dodaje

Answer 18

„kape” na 5’-kraj i poli-A na 3’-kraj

Question 19

hnRNA

Answer 19

heteronuklearna RNA, sadrži introne i egzone

Question 20

što je RNA - polimeraza i razIika kod prokariota i eukariota?

Answer 20

enzim koji sintetizira RNA prema kalupu DNA (ne treba klicu) – DNA-ovisna RNA-polimeraza
 katalizira formiranje fosfodiesterske veze u reakciji nukleofilnog napada 3’-OH skupine riboze na alfa-5’-fosfat ribonukleotid trifosfata
 nema nukleaznu aktivnost
 učestalost greške je ~1/10.000

 Prokarioti
⚫ samo jedna RNA-polimeraza koja sintetizira sve vrste RNA u stanici
 Eukarioti – tri RNA-polimeraze
⚫ RNA-polimeraza I
• sintetizira rRNA (28S, 18S, 5,8S)
⚫ RNA-polimeraza II
• sintetizira hnRNA (mRNA), miRNA
⚫ RNA-polimeraza III
• sintetizira snRNA, tRNA, 5S rRNA

Question 21

Što sintetizira RNA-polim. I

Answer 21

r RNA

Question 22

Tko sintetizira mRNA

Answer 22

RNA - polim. II

Question 23

Što sintetizira RNA-polim II

Answer 23

hnRNA i miRNA

Question 24

Tko sintetizira hnRNA

Answer 24

RNA polim II

Question 25

Što sintetizira RNA polim III

Answer 25

snRNA i tRNA i 5 S rRNA

Question 26

Tko sintetizira miRNA

Answer 26

RNA - polim II.

Question 27

Tko sintetizira mRNA

Answer 27

RNA - polim. 2.

Question 28

Tko sintetizira tRNA

Answer 28

RNA - polim 3.

Question 29

miRNA

Answer 29

(microRNA)
• mala nekodirajuća RNA (~22
nukleotida) postranskripcijska
regulacija ekspresije gena

Question 30

snRNA

Answer 30

(small nuclear RNA)
• sudjeluje u procesiranju hnRNA

Question 31

objasni građu RNA-polimeraza E. Coli

Answer 31

srž enzima
⚫ ima DNA-ovisnu RNA-polimeraznu aktivnost
⚫ sastoji se od 5 podjedinica – dvije α, ß, ß’ i ω
⚫ aktivna je samo ako je na nju vezan σ faktor i tada čini holoenzim
 holoenzim je aktivni oblik, a sastoji se od srži (2α, ß, ß’ i ω) i σ faktora
 σ(sigma) faktor (faktor specifičnosti)
⚫omogućava RNA-polim prepoznavanje različitih vrsta promotora ovisno o vrsti σ-faktora koji je na nju vezan
⚫ disocira nakon inicijacije
⚫ u E.coli postoji 7 grupa σ faktora, npr.
• σ70 spada u 1. grupu i omogućava ekspresiju većine gena u normalnim uvjetima tijekom eksponencijalnog rasta

Question 32

α podjedinica E. coli

Answer 32

odgovorna je za formiranje/sklapanje RNA-polimeraze (prvi korak je dimerizacija α-podjedinica)
⚫ stupa u interakciju s transkripcijskim faktorima, AT-bogatom DNA i UP elementima („upstream promoter element”)

Question 33

ω podjedinica E. coli

Answer 33

nije esencijalna za aktivnost RNApolimeraze,slabo istražena
 pretpostavka: ima ulogu u formiranju RNA-polimeraze

Question 34

ß i ß’ podjedinice E. coli

Answer 34

čine oko 80% mase srži enzima, najveće podjedinice, kodirane genima rpoB i rpoC
⚫ tvore kanal kojim DNA ulazi u aktivno mjesto enzima
⚫ tvore aktivno mjesto enzima
⚫ tvore kanal za ulazak nukleotida
⚫ razdvajaju komplementarne lance DNA
⚫ odvaja novosintetiziranu RNA iz RNA/DNA-hibrida
⚫ tvore strukturu koja okružuje DNA
⚫ tvore savitljivu domenu na otvoru kroz koji izlazi novosintetizirana RNA (RNA prolazi ispod ove domene pa tvorba ukosnice u RNA mijenja konformaciju ove domene, a to rezultira pauziranjem i/ili terminacijom transkripcije)

Question 35

Najčešći promotori u prokariota

Answer 35

Najčešći promotori su oni koje prepoznaje RNA- polimeraza na koju je vezan σ70 faktor – temeljem usporedbe velikog broja ovih promotora predložena je konsenzus sekvencija „tipičnog” promotora

Question 36

Tipični promotor u prokariota (E.coli)

Answer 36

ako se pozicija prvog nukleotida koji se transkribira označi sa +1, tada se konsenzus sekvencija sastoji od regije koja počinje oko pozicije -35
(TTGACA, element -35) i regije koja se nalazi oko pozicije -10 („Pribnow
box”, TATAAT – podgovarajuća regija u ekkariota naziva se TATA-box)
⚫ optimalni razmak između regije -35 i -10 je 17 nukleotida (odstupanje
smanjuje vjerojatnost vezanja RNA-polimeraze)
⚫ osim toga neki jaki promotori (kao što je promotor za rRNA – rrnB P1) sadrže i UP-element („upstream promoter element”) čiji centar se nalazi na oko -42 ili -52 (stupaju u interakciju s α podjedinicom RNA-polimeraze što rezultira nekoliko desetaka puta većom aktivnosti promotora)

Question 37

Pozicija sekvencije koje reguliraju transkripciju, promotora i terminatora

Answer 37

prema dogovoru, sekvencije koje reguliraju transkripciju nalaze se u kodirajućem lancu (onaj koji je „identičan” RNA koja se sintetizira)
⚫ promotor se nalazi na 5’-kraju, a terminator na 3’-kraju kodirajućeg lanca regije DNA koja se transkribira
 orijentacija promotora određuje koji je lanac kodirajuć, a koji nekodirajuć (kalup)

Question 38

Objasni transkripciju u E.coli

Answer 38

Inicijacija
⚫ holoenzim se veže na promotor
⚫ odvajanje komplementarnih lanaca DNA (12 do 15 pb, od regije -10 do pozicije +2 ili +3)
⚫ sinteza započinje s pppG ili pppA, bez klice
⚫ σ faktor disocira nakon što se polimerizira prvih 8 ili 9 nukleotida te započinje elongacija
 Elongacija
⚫ sinteza RNA se odvija u smjeru 5’-3’ (nukleotidi se vežu na 3’-kraj)
⚫ denaturiraju se najviše dva zavoja DNA, DNA/RNA-hibrid je duljine 2 do 3 pb
⚫ 40 nukleotida u sekundi (translacija - oko 15 /aminokiselina u sekundi)
 Terminacija (prekid sinteze RNA na terminatoru te disocijacija RNA-polimeraze i primarnog transkripta RNA) – postoje dvije vrste
⚫ faktor neovisna terminacija
⚫ faktor ovisna terminacija

Question 39

Faktor neovisni (intrinzični) terminatori

Answer 39

sadrže dvije kratke GC-bogate regije nakon kojih slijedi niz od nekoliko A pa zbog toga transkripcijom terminatora nastaje RNA koja sadrži strukturu ukosnice iza koje, na 3’-kraju, slijedi kratki niz U
⚫ struktura ukosnice u RNA stupa u interakciju s RNA-polimerazom što uzrokuje zaustavljanje transkripcije te disocijaciju RNA-polimeraze i RNA s DNA molekule

Question 40

Faktor ovisni (ekstrinzični) terminatori

Answer 40

uključuju
interakciju s jednim od tri terminacijska faktora:
⚫ Rho (ρ), Tau (τ) ili NusA
 Rho ovisna terminacija
⚫ svojstva Rho faktora (kodiran genom rho)
• esencijalan za stanicu
• homoheksamer koji se poput prstena veže na
netranslatiranu RNA i to na regiju rut (rho utilisation,
najčešće 70 ali i do 100 nukleotida) koja ima puno C
i malo G (nema konsenzus sekvencije)
• terminira transkripciju velikog broja operona
• RNA/DNA-helikaza koja disocira RNA-polimerazu s
DNA i oslobađa RNA (još nije sve razjašnjeno;
energiju osigurava hidrolizom ATP-a)

Question 41

Objasni vezanje Rho ovisne terminacije

Answer 41

Rho se veže na sekvenciju rut
Rho dolazi do druge specifične sekvencije
i dobiva ATPaznu aktivnost
Rho sustiže RNA-polimerazu nepoznatim mehanizmom uz utrošak ATP-a
Rho oslobađa RNA nepoznatim mehanizmom

Question 42

Posttranskripcijske modifikacije RNA u bakterija

Answer 42

mRNA ne podliježe posttranskripcijskim modifikacijama
 Na 3’-kraj tRNA se dodaje CCA, a neobične baze nastaju enzimskim modifikacijama uobičajenih ribonukleotida
 primarni transkript rRNA u E.coli se precizno cijepa RNazama te nastaju 5S, 16S i 23S rRNA i neke tRNA
⚫ E.coli ima 7 gena/operona (??)
P1 i P2 – tandemski promotori
 uzvodno od P1 i P2 – tri mjesta za vezanje aktivatora transkripcije Fis (nije prikazano na slici)
 treminatorska sekvencija (ter)
sadrži intrinzični terminator iza kojeg slijedi rho-ovisni terminator

Question 43

Ekspresija gena za rRNA u prokariota

Answer 43

puno molekula RNA-polimeraze istovremeno transkribiraju dva susjedna operona
⚫ obzirom na duljinu transkripata lako je zaključiti da se RNA-polimeraza giba po DNA s lijeva na desno
⚫ za strukturu na 5’-kraju transkripta pretpostavlja se da je početak formiranja ribosoma

Question 44

Procesiranje primarnog transkripta rRNA u E.coli

Answer 44

primarni transkript tvori dvolančane regije koje cijepaju RNaze (npr: RNaza G, RNaza III)
⚫ prikazana je udaljenost mjesta cijepanja od 3’- ili 5’-kraja 16S, 23S i 5S rRNA (npr +115 za Rnazu III, od 5’-kraja 17S RNA)
⚫ prikazane su RNaze koje uklanjaju „višak” nukleotida na rRNA koji ostaje nakon cijepanja
(npr RNaza T koja uklanja 7 tj 3 nukleotida s fragmenta koji sadrži 23S i 5S rRNA)

Question 45

Transkripcija u eukariota

Answer 45

Odvija se u jezgri, odijeljena od translacije, tri RNA-polimeraze (I, II i III)
⚫ 8 do 14 podjedinica, više od 500 kDa
⚫ RNA-pol I prepoznaje samo jednu vrst promotora (za gene za rRNA)
⚫ RNA-pol III prepoznaje promotore za snRNA, tRNA, 5S rRNA (mogu se nalaziti
uzvodno, nizvodno ili unutar gena)
⚫ Promotori za RNA-pol II mogu biti jednostavni ali i jako kompleksni
 Mnogo kompleksnija nego u prokariota
 mRNA (hnRNA, pre-mRNA, primarni transkript) podliježe velikim posttranslacijskim
promjena (rRNA i tRNA modificiraju se u prokariota i eukariota, ali mRNA samo u eukariota) – „kapa” na 5’-kraju i poli A na 3’-kraju te „splicing” (izrezivanje introna) i alternativni „splicing”
 Osim promotora (cis-djelujuća sekvencija), eukarioti imaju pojačivače („enhancer”) koji jako povećavaju aktivnost promotora
 RNA-polimeraza se može vezati na promotor tek nakon što su na njega vezani transkripcijski faktori

Question 46

Promotor za RNA-polimerazu II

Answer 46

Najvažniji dio promotora je „TATA box” (sličan -10 sekvenciji u prokariota) koji se najčešće nalazi na poziciji -30 do -100, osim toga:
⚫ dodatni elementi promotora nalaze se u regiji od -40 do -150:
• „CAAT box” (konsenzus; GGNCAATCT)
• „GC box” (konsenzus: GGGCGG) – najčešće ih sadrže konstitutivni geni (stalno se eksprimiraju)
 CAAT i GC boxovi, u različitim promotoroma se nalaze na različitim mjestima (u bakterija se elementi promotora nalaze na „fiksnim” pozicijama), a
djeluju i ako se nalaze na nekodirajućem lancu tj u obratnoj orijentaciji (u bakterija svi elementi moraju biti u određenoj orijentaciji)
⚫ Ovo je moguće jer se u eukariota na ove elemente, za razliku od prokariota, ne veže samo RNA-polimeraza, nego drugi proteini (prvenstveno transkripcijski faktori)

Question 47

Inicijacija transkripcije u eukariota

Answer 47

Za vezanje RNA-pol II na promotor neophodno je
prethodno vezanje transkripcijskih faktora svrstanih u
grupu TFII (TF – transkripcijski faktor; II – RNA-pol II)
⚫ na TATA box se najprije veže TFIID (700 kDa), pa TFIIA, pa TFIIB, pa TFIIF (ATP-ovisna helikaza koja razdvala lance DNA)
⚫ Tek sada se veže RNA-pol II pa TFIIE te ovako nastaje osnovni transkripcijski kompleks – omogućava nisku razinu ekspresije gena, a za jaču ekspresiju potrebno je vezanje TF na GC i CAAT boxove, kao i djelovanje pojačivača („enhancer”)
⚫ Bakterije nemaju ove proteine koji se vežu na TATA box (TBP – TATA-Box-Binding Protein) ali arheje imaju TBP koji su slični eukariotskim TBP. Transkripcija u arhejama sličnija je transkripciji u eukariota što ukazuje na evolucijsku povezanost.

Question 48

kako nastaje osnovni transkripcijski kompleks

Answer 48

na TATA box se najprije veže TFIID (700 kDa), pa TFIIA,
pa TFIIB, pa TFIIF (ATP-ovisna helikaza koja razdvala
lance DNA)
⚫ Tek sada se veže RNA-pol II pa TFIIE

Question 49

Pojačivači i prigušivači transkripcije te izolatori

Answer 49

pojačivači („enhancer”)
⚫ u kvascu se nazivaju upstream activator sequence (UAS)
⚫ cis-djelujući elementi koji djeluju na aktivnost promotora koji je od njih udaljen i nekoliko kb, a mogu se nalaziti uzvodno, nizvodno ili unutar gena
⚫ pojedini pojačivači aktivni su samo u određenim stanicama/tkivima
Pojačivači i prigušivači transkripcije te izolatori
 prigušivači („silencer”) smanjuju razinu ekspresije gena
 izolatori („insulator”) sprječavaju da način regulacije jednog promotora utječe na susjedne gene
 potrebni su i kromatinremodelirajući
proteini i histon acetilaze (ukupno više od 100
različitih proteinskih podjedinica)

Question 50

Modifikacija pre-mRNA u eukariota

Answer 50

pre-mRNA(primarni transkript,heterogena nuklearna RNA,hnRNA)počinje se modificirati već tijekom transkripcije
Eukarioti imaju monocistronsku mRNA koja na 5’-kraju ima „kapu”, a na 3’-kraju 150 do 250 dugačak poli A
„kapa” se dodaje na 5’ kraj novosintetizirane RNA kad je ona dugačka tek oko 26 nukleotida, a omogućuje stanici da razlikuje mRNA od ostalih RNA u stanici (RNA koje sintetiztiraju RNA-pol I i III nemaju kapu), na nju se vežu proteini koji imaju ulogu u „splicingu” i transportu RNA

Question 51

Objasni splicing

Answer 51

u pravilu introni mnogostruko dulji od egzona pa
kodirajući dio DNA (ORF) često čini jako mali dio gena

introni mogu biti dugački od 10 do više od 100.000 nukleotida
 na 5’-kraju introna u pravilu se nalazi GU, a na 3’-kraju AG
 za uklanjanje introna važne su tri sekvencije – početak (A) i kraj introna (B) te regija unutar
introna koja sadrži specifični A (C)

izrezivanje svakog introna odvija se u dva koraka transesterifikacije
⚫ nastaje fosfodiesterska veza između 2’-OH specifičnog A i 5’-kraja introna te nastaje oblik omče i pojavljuje se slobodni 3’-OH kraj egzona
⚫ novonastali 3’-OH kraj egzona tvori fosfodiestersku vezu s 5’-krajem slijedećeg egzona što uzrokuje odvajanje introna u oilbiku omče
⚫ splicing provode ribonukleoproteinski kompleksi („spliceosome”) koji se sastoje od 5 različitih molekula RNA (small nuclear RNA, snRNA, kraće
od 200 nukleotida) i više od 50 proteina

Question 52

Alternativno procesiranje RNA

Answer 52

regulirani proces koji omogućuje da jedan te isti gen kodira za najmanje dva proteina i to zbog toga jer se određena hnRNA može procesirati na više od jednog načina
 najčešće se osniva na uključivanju ili ne uključivanju pojedinih egzona u zrelu mRNA, ali pri tome ne dolazi do promjene redoslijeda egzona
⚫ primjer gena za α-tropomiozin štakora (ljubičasti trokuti označavaju signal za poliadenilaciju)

Question 53

Poliadenilacija 3’-kraja mRNA

Answer 53

u DNA postoje signali za poliadenilaciju koji se transkribiraju u hnRNA te ih prepoznaju „RNA-binding proteins” i „RNA-processing enzymes” što rezultira
cijepanjem hnRNA pa poli-A polimeraza na 3’-kraj polimerizira oko 200 A
 Nakon što se hnRNA pocijepa i poliadenilira, RNA-polimeraza II nastavlja transkribirati DNA te sintetizira još nekoliko stotina nukleotida prije nego
što disocira s DNA (proces terminacije transkripcije u eukariota još nije potpuno razjašnjen)
 C-terminalna domena najveće pojedince RNA-pol II (ß’) sadrži veliki broj serina(humana RNA-polimeraza 104) koji se fosforiliraju neposredno prije početka
transkripcije
⚫ na ovoj domeni vezani su najvažniji proteini/enzimi koji sudjeluju u dodavanju kape, izrezivanju introna i poliadenilaciji mRNA

Question 54

što je translacija?

Answer 54

biološki proces „prevođenja” genetičke informacije,
koja se nalazi u mRNA, u redoslijed aminokiselina
u polipeptidnom lancu
 način/pravilo prema kojem se genetička uputa
zapisana u DNA i mRNA prevodi u redoslijed
aminokiselina naziva se genetički kod

Question 55

Početak otkrivanja gen.koda

Answer 55

u slučaju genetičkog koda redoslijed nukleotida je šifrirana poruka, a redoslijed aminokiselina (ak) u polipeptidnom lancu dešifrirana poruka
⚫ u vrijeme otkrivanja genetičkog koda bilo je moguće odrediti redoslijed ak, ali sekvencioniranje DNA bilo je moguće tek 15 godina kasnije
⚫ stoga je genetički kod trebalo otkriti eksperimentalno

Question 56

Koje su još informacije i metode u vrijeme otkrivanja genetičkog koda bile dostupne?

Answer 56

bilo je jasno da redoslijed nukleotida (nt) na neki način određuje redoslijed ak
⚫ pretpostavljalo se da tri nt (triplet) kodira jednu aminokiselinu te da se ti tripleti ne preklapaju
• kad bi se kod osnivao na jednom nt bilo bi moguće kodirati samo 4 različite ak jer posoje samo 4 različita nt
• kod od 2 nt mogao bi kodirati 16 ak (42), a kod od 3 nt (triplet) može kodirati za 64 (43) ak – dakle i više nego dovoljno za postojećih 20 ak
bilo je moguće provesti translaciju in vitro tako da se u stanični ekstrakt (koji je sadržavao ribosome, tRNA, aminoacil-tRNA sintetazu, mRNA i ATP) dodaju
aminokiseline
• dodatak radioaktivnih aminokiselina rezultirao bi radioaktivnim proteinskim talogom
•5 godina prije otkrića RNA-pol) otkriven je enzim koji može
polimerizirati RNA iz nukleotid difosfata bez kalupa (nazvan polinukleotid
fosforilaza)
• nasumično polimerizira A, U, G i C u udjelu u kojem su dodani u reakcijsku otopinu
• ako su npr. prisutni samo U, sintetizirat će poli-U: UUUUUUUUUUUUUUUU

Question 57

Postignuće Nirenberga

Answer 57

in vitro translacija sintetskih RNA (dobivenih pomoću
polinukleotid fosforilaze)
⚫ translacija poli-U rezultirala sintezom poli-fenilalanina
• zaključak: kod (kodon) on za fenilalanin sastoji se samo od U tj UUU
⚫ translacija poli-C rezultirala sintezom poli-prolina
⚫ translacija poli-A rezultirala sintezom poli-lizina
⚫ translacija poli-G rezultirala sintezom poli-glicina
⚫ translacija RNA koji sadrže jednaki udio 2 nukleotida (poli-UA, poli-UC i poli-UG)
• sve tri RNA rezultirale su određenim udjelom fenilalanina (kao i poliU), zbog nasumične sinteze pa se u RNA može pojaviti UUU
• poli-UA rezultirao je ugradnjom fenilalanina, lizina, tirozina i izoleucina
lizina, dakle kodoni za tirozin i izoleucin sadrže U i A; usporedbom
frekvencija ugradnje tirozina i izoleucina prema fenilalaniunu i očekivanim frekvencijama kodona U2A, UA2, i A3 u odnosu na kodon U3 kodon pokazalo se da je sastav kodona za tirozin i leucin U2A.
• leucin se ugrađivao i u slučaju poli-UC i poli-UG što znači da je kodiran s još najmanje 2 različita kodona (jedan sadrži U i C, a drugi U i G)
međutim, ovako se nije mogla otkrit točna sekvenca kodona, nego samo njihova empirijska formula (npr U2A)
Khorana je uspio sintetizirali RNA određenog slijeda nukleotida:
• …UGUGUGUGUG… – rezultat – …valin-cistein-valin-cistein…
• dokaz da se kodon sastoji od neparnog broja nukleotida
• …UUGUUGUUGUU… – rezultat – tri različita polipeptidna lanca: poli-leucin,
poli-cistein i poli-valin
• dokaz da kodon sadrži 3 nt (triplet) ili višekratnik broja 3
 Dok je Khorana radio na sintezi RNA točno određenog slijeda nukleotida
kompleksnog sastava, Nirenberg je 1964. godine proveo eksperiment kojim je
otkrio/dešifrirao/probio genetički kod
⚫ proveo povijesni eksperiment iz 1964. godine:
• iskoristio činjenicu da ribosomi ne prolaze kroz nitrocelulozni filter ali prolaze aminokiseline, tRNA i aminoacil-tRNA
na primjeru trinukleotida/tripleta UUU i aminoacil-fenilalanin-tRNA pokazao da
ribosom u prisustvu trinukleotida veže samo onu aminoacil-tRNA čiji antikodon se
sparuje s tim trinukleotidom
⚫ u otopinu određenog tripleta i ribosoma dodavao pojedine aminoacil-tRNA s radioaktivnom ak i propuštao kroz nitrocelulozni filter
⚫ radioaktivnost na filteru bila je dokaz za je dodani triplet kodon za upravo tu određenu radioaktivnu ak
ovako su otkriveni kodoni za sve ak te je predložena tablica genetičkog koda –„periodni sustav za biologe”
pokazano je da tri tripleta (kodona) ne kodiraju ni
za jednu aminokiselinu (Stop kodoni)
 ima puno „sinonimnih kodona” koji kodiraju za
istu aminokiselinu – genetički kod je
„redundantan”
 unatoč redundantnosti, genetički kod je jednoznačan (osim za Stop kodone) jer niti jedan kodon ne kodira za više od jedne ak
 sinonimni kodoni, u pravilu se razlikuju u trećem i/ili drugom nukleotidu – iznimka su arginin, serin i Ieucin koji imaju po 6 različitih kodona pa se oni i moraju razlikovati i u prvoj bazi

Question 58

kodon prolina

Answer 58

Ccc

Question 59

kodom lizina

Answer 59

AAA

Question 60

kodan glicina

Answer 60

GGG

Question 61

kodon fenilalanina

Answer 61

UUU

Question 62

kodon tirozina

Answer 62

Poli-UA

Question 63

kodon izoleucina

Answer 63

poli-UA

Question 64

Postignuće Khorane?

Answer 64

uspio sintetizirali RNA određenog slijeda nukleotida:
• …UGUGUGUGUG… – rezultat – valin-cistein-valin-cistein…
• dokaz da se kodon sastoji od neparnog broja nukleotida
• …UUGUUGUUGUU… – rezultat – tri različita polipeptidna lanca: poli-leucin, poli-cistein i poli-valin
• dokaz da kodon sadrži 3 nt (triplet) ili višekratnik broja 3
 Dok je Khorana radio na sintezi RNA točno određenog slijeda nukleotida kompleksnog sastava, Nirenberg je 1964. godine proveo eksperiment kojim je otkrio/dešifrirao/probio genetički kod
⚫ proveo povijesni eksperiment iz 1964. godine:
• iskoristio činjenicu da ribosomi ne prolaze kroz nitrocelulozni filter ali prolaze aminokiseline, tRNA i aminoacil-tRNA

Question 65

što su sinonimni kodoni i što omogućuju? Kako su otkriveni?

Answer 65

kodiraju za istu aminokiselinu – genetički kod je „redundantan”
 unatoč redundantnosti, genetički kod je jednoznačan (osim za Stop kodone) jer niti jedan kodon ne kodira za više od jedne ak
 sinonimni kodoni, u pravilu se razlikuju u trećem i/ili drugom nukleotidu – iznimka su arginin, serin i leucin koji imaju po 6 različitih kodona pa se oni i moraju razlikovati i u prvoj bazi
 sinonimni kodoni „omogućuju” postojanje organizama s vrlo različitim udjelom GC i AT parova baza (zadnji slajd 2. predavana) ali je također pokazana i međuovisnost
zastupljenosti pojedinih ak u proteinima obzirom na AT/GC sastav DNA
 također, uobičajeno je da je u pojedinim organizmima jedan sinonimni kodon značajno više zastupljen od ostalih – „kodon bias” – „pristrana uporaba sinonimnih kodona”
u prvim eksperimentima pokazano je da se na poli-UC i poli-UG vežu dvije
različite tRNA za leucin (Leu-tRNA I i Leu-tRNA II) temeljem čega je zaključeno da
za svaki kodon postoji po jedna tRNA (ukupno 64, odnosno 61 kad je ustanovljeno da postoje 3 stop kodona)
 međutim, Nirenbergov eksperiment iz 1964 pokazao je da mnoge tRNA prepoznaju više od jednog sinonimnog kodona (npr tRNA za alanin veže se na GCU, GCC i GCA) dok neke prepoznaju samo jedan kodon (npr leu-tRNAII iz E.coliprepoznaje samo UUG)
 temeljem ovih istraživanja predložena je tzv „wobble hipoteza” prema kojoj samo prve dvije baze kodona (baze na 5’-kraju kodona) na mRNA uspostavljaju stabilnu
vezu s antikodonom
 wobble hipoteza – treća baza kodona u mRNA stvara nestabilnu („kolebljivu”) vezu s prvom bazom antikodona

Question 66

orijentacija kodona

Answer 66

Obzirom da se RNA sintetizira u smjeru 5’-3’ (novi nukleotidi se vežu na 3’-kraj) bilo je logično da se u tom smjeru čitaju i kodoni (od 5’ prema 3’ kraju RNA), ali i
to je trebalo eksperimentalno dokazati tj trebalo je dokazati je li kodon za primjerice glicin 5’-GGT-3’ ili 5’-TGG-3’
⚫ pomoću polinukleotid fosforilaze sintetizirana RNA u prisustvu A i C u omjeru 20:1 pa nastaje RNA koja u prosijeku izgleda ovako: 5’…A20-C1-A20-C1…3’
⚫ ova RNA tretirana s RNazom iz gušterače koja cijepa RNA iza 3’-fosfata pirimidina pa nastaju RNA koje se sastoje od poli-A koji završava s C na 3’-kraju: 5’AnC-3’
⚫ in vitro translacijom ovakvih RNA nastali su polipeptidi: ….Pitanje za bonus bodove na Merlinu …. što je riješilo pitanje orijentacije kodona u tablici genetičkog koda

Question 67

Objasni start kodon i inicijacija translacije u bakterija

Answer 67

Start kodon ima posebnu ulogu jer označava mjesto početka sinteze proteina i na njega se veže posebna formilmetionil-tRNA
 U stanici postoje dvije metionil-tRNA
⚫ jedna je inicijacijska i ona se formilira aktivnošću formilacijskog enzima
⚫ druga je uobičajena metionil-tRNA koja služi za ugradnju metionina unutar lanca
⚫ obje ove metionil-tRNA prepoznaju AUG kodon
⚫ međutim formilmetionil-tRNA, osim AUG kodona (metionin), prepoznaje i GUG kodon (valin), a ima slabi afinitet i za UUG i CUG (leucin) !?!
⚫ iz ovoga proizlazi da inicijacijska tRNA „poštuje” wobble hipotezu na drugačiji način od svih ostalih tRNA – 2. i 3. baza kodona mRNA stvara stabilnu vezu, a 1. baza nestabilnu (wobble) vezu
 Pri inicijaciji translacije, ribosom se veže za specifičnu sekvenciju na mRNA (ribosome binding-site, RBS, Shine-Dalgarno) koja je djelomično komplementarna s
3’-krajem 16S rRNA
Prokarioti osim AUG koriste alternativne start kodone, najčešće GUG i UUG
U E.coli za inicijaciju translacije,kao start kodoni koriste se:
⚫ AUG, 82,7 %, u 3542 do ukupno 4284 ORF-a
⚫ GUG, 14,3 %, u 612 ORF-ova
⚫ UUG, 2,4 %, u 103 ORF-ova ali i AUU I CUG
 Istraživanje iz 2017. godine: osim AUG, još 17 kodona može djelovati start kodon

Question 68

Inicijacija translacije u eukariota

Answer 68

Geni na kromosomima u jezgri (translatiraju se u citoplazmi)
⚫ inicijacijska metionil-tRNA koja se veže na start kodon (AUG) se ne formilira
 Geni kodirani genomom organela (mitohondriji i plastidi; translagtiraju se u organelima)
⚫ inicijacijska metionil-tRNA koja prepoznaje start kodon se formilira

Question 69

sekvencije koje reguliraju transkripciju

Answer 69

Sekvencije koje reguliraju transkripciju uključuju:

1. Promotor: Sekvenca DNK koja je mjesto vezanja RNA polimeraze i drugih faktora za inicijaciju transkripcije gena.
2. Operator: Sekvenca DNK koja regulira pristup RNA polimeraze promotoru i može biti mjesto vezanja regulatornih proteina koji kontroliraju transkripciju.
3. Enhanceri: Sekvenca DNK koja može povećati transkripciju gena kada je vezana od strane odgovarajućih transkripcijskih faktora.
4. Silenceri: Sekvenca DNK koja može smanjiti ili inhibirati transkripciju gena kada je vezana od strane odgovarajućih transkripcijskih faktora.
5. Repressori: Proteini koji se vežu za operator i sprječavaju vezanje RNA polimeraze na promotor, inhibirajući tako transkripciju gena.
6. Aktivatori: Proteini koji se vežu za enhancere i potiču vezanje RNA polimeraze na promotor, potičući tako transkripciju gena.

Ove sekvence i elementi regulacije transkripcije igraju ključnu ulogu u kontroliranju ekspresije gena u stanicama.

Question 70

duljina DNA-RNA hibrida

Answer 70

2-3 pb

Question 71

Koji Enzim treba klicu

Answer 71

rna polimeraza ne treba ali dna treba