Réplication Flashcards
Qu’est-ce que la réplication de l’ADN
Processus de doublement du contenu en ADN d’une cellule- mère en mitose afin de transmettre l’ensemble de son potentiel génétique aux deux cellules-fille
La réplication de l’ADN se pass durant quelle phase de la mitose?
Phase S, et c’est le préalable obligé de la division cellulaire
Mode de réplication de l’ADN
Séparation des deux brins de l’ADN, puis chaque brins sert de brin matrice pour former un brin complémentaire. Chaque nouvelle molécule fille va seulement garder la moitié de la molécule mère. Les autres brins sont néoformés.
Le mécanisme de réplication est universel chez qui?
-procaryotes
-eucaryotes
-archéobactéries
Mais les enzymes de réplication impliqués sont différents
Vitesse de réaction de l’ADN chromosomique chez E. coli (procaryote)
1000 pb/s
Temps de réplication total de l’ADN E. coli
20-30min
Temps de réplication total du génome des eucaryotes _ précisions
1h
-Problèmes supplémentaires: ADN eucaryote linéaire, beaucoup plus grand et plus empaqueté
-Réponses aux problèmes: stock d’ADN polymérases nettement plus important et plusieurs origines de réplication.
-Étapes additionnelles à cause des modifications de structure de la chromatine. Par exemple, la synthèse de nouvelles molécules d’histones apparait simultanément au processus de réplication. Les histones restent fixées à l’ADN pendant la réplication
Qu’est-ce que l’ADN polymérase?
Des enzymes qui assurent la synthèse d’un nouveau brin d’ADN à partir d’un brin de matrice
L’ADN polymérase catalyse quoi?
Elles catalysent la formation de liaison phosphodiester entre l’extrémité 5’P du nucléotide incorporé et l’extrémité 3’OH de la chaîne en croissance.
L’ADN polymérase a donc besoin d’une amorce pour fonctionner.
voir p.7 pour le tableau
Explications de l’expérience pour faire réplication de l’ADN
voir p.4
Les ADN polymérise ont besoin de quoi pour commencer la synthèse?
Amorce pré-existante (ARN) et d’une matrice
-> Amorce d’ARN pour la réplication, amorce d’ADN pour la réparation et la recombinaison
L’activité exonucléase 3’ -> 5’ permet quoi?
De contrôler la fidélité de la réplication en éliminant les nucléotides incorporés par erreur
Voir p.8
Polymérase I, caractéristiques
-activité polymérase 5’ -> 3’
-activité exonucléase 3’ -> 5’ pour le relecture
-activité exonuclase 5’ -> 3’ permet d’éliminer les amorces d’ARN des fragments d’Okazaki pendant la réplication
-Son activité polymérise permet la synthèse d’ADN destiné à être immédiatement suturé par une ADN ligase. Enzyme peu processive, elle se dissocie de la matrice après l’ajout d’une vingtaine de nucléotides
Polymérase II, caractéristiques
-activité polymérase 5’ -> 3’
-activité exonucléase 3’ -> 5’
-impliquée dans la réparation de l’ADN endommagé
-peu processive
Polymérase III, caractéristiques
-Principale polymérase intervenant dans l’élongation du brin avancé et de la synthèse des fragments d’Okazaki
–Très processive
Polymérase IV, caractéristiques
Polymérases de la famille Y, caractérisées par leur capacité à tolérer des lésions de l’ADN lors de la réplication (polymérase de translésion). Elles ne possèdent pas de fonction exonucléase 3’ -> 5’. Leur fidélité lors de la synthèse de l’ADN est faible, même en absence d’ADN endo
Principale enzyme impliquée dans la réplication du chromosome bactérien
ADN polymérase III
ADN polymérase III, complexe ___ comprenant ___ sous-unités
dimérique asymétrique
17
(10 sous-unités différentes)
Qui est responsable de l’activité de polymérisation dans ADN polymérase III?
Polypeptide a
Sous unités de l’ADN polymérase III
-Sous-unité E (epsilon) contient l’activité exonucléase 3’ -> 5’.
-Les sous-unités B forment un anneau coulissant
qui entoure la double hélice d’ADN et coulisse
le long de la molécule. Cet anneau permet de
maintenir le noyau de l’enzyme proche de
l’ADN et empêche la polymérase de se
détacher trop rapidement
-> Forte processivité (> 50 kpb) -> avantage : il suffit d’un petit nombre d’enzymes processives pour copier l’entièreté du génome
voir p.10 pour l’image
ADN polymérase III : correction de copie
-L’activité de correction d’erreur de l’ADN
polymérase dépend de son activité 3’→5’ exonucléase.
-Cette activité se produit à l’endroit où l’enzyme se sépare de son site d’activité 5’→3’ polymérase.
-Lors de l’introduction d’un nucléotide
désapparié dans le domaine de polymérisation,
la synthèse d’ADN arrête (cinétique
d’appariement de base non-favorable).
-La pause permet l’excision du mauvais
nucléotide (activité exonucléase) et son
remplacement par le bon nucléotide par
l’enzyme (activité polymérase)
Nucléotide erroné = 1 sur 10àla5
Avec correction de la polymérase III = 1 sur 10àla7
Avec autres mécanismes = 1 sur 10àla10
Technique PCR
Utilise une polymérase résistante à la température (jusqu’à 100 degrés) isolée de la bactérie Thermophilus aquaticus -> Taq pol
*Taq pol : activité polymérase mais pas d’activité exonucléase 3’ - 5’
Processus de technique PCR
-1 cycle = 3 étapes (2-3 heures pour 30 cycles)
-Dénaturation
-> 94 degrés C pendant 2 minutes
-> Séparation des 2 brins d’ADN
-Hybridation des amorces
-> Les 2 amorces (18-24 nucléotides) s’attachent à leur séquence complémentaire
-> Le choix du couple d’amorces définit les limites 5’ et 3’ de la séquence à amplifier (amplicon)
-> Température dépend de la séquence des amorces Th = Tm - 5 degrés; pendant 30 secondes (exemple 55-56 degrés C)
-> Les amorces doivent avoir un maximum de divergence et éviter l’autocomplémentarité (éviter l’hybridation entre amorces).
-> Pas plus de 2 degrés C de différence entre les Tm des amorces
-Élongation
-> enzyme à une excellente activité au-dessus de 70 degrés (température fixée à 72 degrés, 2 min)
Vrai ou faux, la matrice est 5’ -> 3’
Faux, 3’ -> 5’
VRAI OU FAUX : Amplification exponentielle d’un fragment d’ADN -> la quantité quadruple à chaque cycle
Faux, elle double
PCR classique vs RT-PCR
PCR classique :
-recherche d’anomalie génétique
-génotypage
-empreinte génétique
-clonage
RT-PCR :
-mesure l’expression de gène d’intérêt
-alternative au nothern blot
La réplication de l’ADN débute à partir de quoi?
À partir de l’origine de réplication et progresse dans les deux sens à partir de ce point créant 2 fourches de réplication.
La réplication de l’ADN est unidirectionnelle ou bidirectionnelle?
Bidirectionnelle
Fonctionnement en gros de la réplication
Des protéines, les facteurs d’initiation de la réplication
vont reconnaître les origines de réplication. Le rôle de
ces facteurs d’initiation est de faciliter la fixation d’autres
protéines qui elles aussi vont se fixer à ces origines de
réplication. Ces protéines permettent l’ouverture des
deux brins de l’ADN et ainsi «faire apparaître» des fourches de réplication
Étapes de la réplication
-initiation
-élongation
-terminaison
Initiation
Qu’est-ce que le primosome ?
La réplication de l’ADN nécessite l’ouverture de la double hélice d’ADN
–L’ADN des bactéries ne possède qu’une seule origine de
réplication, contrairement à celui des eucaryotes qui en possède plusieurs (environ 20 000). Ces origines de réplication définissent des unités de réplication
d’environ 100 à 200kpb (réplicon).
–La protéine DnaA interagit avec cette région pour rompre les liaisons hydrogène et former la fourche de
réplication (étape demandant de l’ATP).
–À partir de l’origine, la réplication se propage de façon bidirectionnelle (2 fourches de réplication).
–Une hélicase s’y engouffre et sépare les brins dans les deux sens en rompant les liaisons hydrogène entre
les deux brins de la double hélice d’ADN.
–De part et d’autre des deux fourches de réplications, des topoisomérase enlèvent les supertours positifs
engendrés par la formation de l’œil de réplication.
–Chez les procaryotes, les protéines SSB (single
strand binding) se fixent pour stabiliser les simples brins
d’ADN et empêchent la reformation du double brin. Chez les eucaryotes, les protéines RPA jouent ce rôle.
PRIMOSOME :
Chez les procaryotes, le complexe multienzymatique composé de l’hélicase et de la primase est appelé
le primosome
Élongation
-formation de quoi
-progresse dans quel sens
-brins directs et indirects
-formation du réplisome et synthèse de l’ADN
-L’élongation de l’ADN polymérase progresse toujours dans le sens 5’ -> 3’ pour le brin en création MAIS les deux brins de la double hélice sont enroulés dans des sens opposés = antiparallèles -> mécanismes différents selon le brin d’ADN répliqué
-il existe un brin direct ou précoce et un brin indirect ou retardé ou tardif -> brin indirect = créé de façon discontinue, sous forme de fragments d’Okazaki dans le sens 3’ -> 5’
Élongation, explications
-L’ADN polymérase a besoin d’une amorce puisqu’elle ajoute des nucléotides à l’extrémité 3’ OH d’une chaîne .
-Cette amorce sera composée par des ARN (3-60 ribonucléotides)
-> Seules les enzymes ADN polymérase et ARN polymérase synthétisent des chaines nucléotidiques…et l’ADN polymérase a besoin d’une amorce!
-La primase synthétise les amorces d’ ARN. Elle fait partie du complexe du primosome
-> Assure son propre mouvement le long de la chaîne d’ADN
-> Déplace les SSB.
-> Effectue la polymérisation des amorces d’ARN
-Les jonctions ARN-ADN seront ensuite éliminées par une
Rnase H.
-Des ADN polymérases vont ensuite remplir les trous laissés par les amorces disparues
-ADN ligase élimine les coupures
Pol a
-Synthétise de courtes séquences d’ADN (environ 20 nucléotides) à la suite des amorces synthétisées par la primase (les deux enzymes font partie d’un même complexe)
–Ne possède pas l’activité exonucléase 3’ -> 5’
Pol B
-Impliquée dans des processus de réparation de l’ADN.
–Correspond à la polymérase II des procaryotes
Pol delta
-Polymérase principale dans la réplication de l’ADN chez les eucaryotes avec Pol ε (synthèse du brin avancé et du
brin retardé).
–Activité exonucléase 3’ vers 5’ (correction des erreurs et réparation).
–Très processive lorsqu’elle est associée au
PCNA (‘DNA clamp’)
–Correspond à la polymérase III des procaryotes
Pol epsilon
-Activité polymérase 5’ → 3’ et une activité exonucléase 3’ → 5’
–Impliquée dans la réplication et la réparation de l’ADN (synthèse du brin avancé).
–Très processive même sans association avec PCNA
Terminaison
-Les fourches de réplication rencontrent un signal de terminaison de la réplication
-La protéine Tus reconnait les séquences d’arrêt et bloque l’hélicase
-La séparation des 2 chromosomes est effectuée par une topoisomérase
Réparation de l’ADN
ADN = seule macromolécule que la cellule peut réparer
Conséquences d’une mutation sur l’ADN
-chez organisme unicellulaire
-chez un organisme multicellulaire
-Chez un organisme unicellulaire
*La modification d’un gène vital peut entraîner la mort de l’organisme
*Une mutation d’un gène va être transmis à la descendance
–Chez un organisme pluricellulaire
*La modification d’un gène peut entraîner une tumeur ou une perte de fonction avec mort cellulaire
*La mutation d’un gène n’est pas transmise à la descendance sauf si elle touche le génome d’une cellule germinale
Dommages à l’ADN
Causés par des radiations ionisantes ou des substances chimiques
voir p.24
Réparation de l’ADN, méthodes
-par excision de bases (ber)
-par excision de nucléotides (ner)
Réparation par excision de bases
Éliminer une base ayant subi une modification
-Une ADN glycosylase reconnait la base modifiée.
-> Elle coupe la liaison N-glycosidique (site abasique).
-Ce site est éliminé par une endonucléase (coupure du lien phosphodiester côté 5’ du sucre) et par l’activité phosphodiestérase de l’ADN Pol B (coupure de l’autre liaison).
-La Pol B remplace le nucléotide.
-Une ADN ligase referme le brin
Réparation par excision de nucléotides
Permet la réparation de dimères de thymines induits
par les rayonnements UV.
-La lésion est reconnue par des protéines XP
-Ces protéines clivent le brin endommagé à quelques
dizaines de nucléotides de la lésion grâce à leur
activité endonucléase.
->Libération d’un brin d’environ 30 nucléotides
-La brèche est comblée par les ADN Pol delta et epsilon et la ligase assure la ligation du brin
Xéroderma pigmentosum
*Maladie des enfants de la Lune
*Maladie héréditaire rare
*Caractérisée par une sensibilité excessive de la peau aux rayons UV, des troubles oculaires et un risque fortement accru de développer un cancer de la peau ou des yeux.
*Maladie causée par une déficience en protéines XP. Les mécanismes de réparation de l’ADN sont inopérants et les mutations causées par l’environnement s’accumulent au cours des mitoses successives, diminuant significativement l’espérance de vie du malade
Réparation des mésappariements (mmr)
voir p.28
Réparation des cassures double brin
voir p.29
ADN polymérase de translésion
*Si des erreurs échappent à la réparation par les polymérases traditionnelles et constituent un
blocage à la réplication, la cellule recrute de polymérase de translésion
*Polymérases qui répliquent la zone lésée avant que la polymérase traditionnelle ne reprenne son travail.
*Ces polymérase ne possèdent pas d’activité de relecture et peuvent induire des mutations au niveau de la zone lésée lors de la réplication
