Régulation de la transcription chez les eucaryotes Flashcards
Que font les isolateurs?
Ils bloquent l’activation par les activateurs (enhancers). Bloque la communication.
Quand est-ce que les isolateurs vont avoir un effet?
Agit seulement lorsque placé entre le promoteur et l’activateur (pas sur les autres gènes contrôlés par l’activateur).
Vrai ou faux; L’isolateur agit directement sur le promoteur ou directement sur l’activateur.
Faux; il n’agit ni directement sur le promoteur, ni sur l’activateur mais, il bloque la communication entre les deux.
Vrai ou faux; Chez les individus présentant la maladie BWS, les deux allèles (chromosome) sont méthylés. (Un de la mère et l’autre du père).
Vrai. Voir diapo 32.
Qu’est-ce qui empêche un activateur qui agit sur un gène situé à 50kb d’activer les autres gènes situés plus près?
Ils sont protégés par des isolateurs.
Qu’est-ce que les Locus Control Region (LCR) et que font-ils?
Ce sont des promoteurs et régulent l’expression de plusieurs gènes. Diapo 35
Donnez les quatre mécanismes d’action des FT (activateurs et répresseurs).
1- Co-facteur
2- Modification post-traductionnelle
3- Complexe avec un ligand
4- Action restreinte à un type cellulaire
Comment est-il possible d’activer un gène précis? Diapo 37-38.
Par l’action de différents stimulis internes ou externes entraînant la liaison d’un certain nombre de facteurs de transcription particuliers à certaines séquences d’ADN régulatrices situées sur le promoteur.
Vrai ou faux; La découverte de l’opéron Y a été fait par Jacob et Monod.
Faux, c’est la découverte de l’opéron Iac.
Quel est le bilan du mécanisme d’interférence d’ADN?
Il a régulation de l’expression par l’ARN.
Comment fonctionne le mécanisme d’interférence d’ADN?
- Régulé par de courts segments l’ARN (short RNA)
- S’apparient à un ARN de séquence homologue, provoquent la dégradation, donc prévient la traduction et agissent au niveau de la chromatine.
Combien de bases possède les shorts ARN?
80 à 100 bases (simple brin).
Vrai ou faux; Chez les eucaryotes, les petits ARN sont codés par des gène, une centaine pour E. Coli.
Faux, chez les procaryotes.
Vrai ou faux; Le mécanisme de l’interférence de l’ARN est similaire chez les procaryotes et les eucaryotes (quelques différences).
Vrai.
Nommez trois différences entre le mécanisme de l’interférence de l’ARN chez les procaryotes et chez les eucaryotes.
1- Molécules portent différents noms (mais processus commun s’appelle RNAi)
2- Courtes molécules de 21-30 bases, entre 100-200 de ces petits ARN selon les eucaryotes
3- Sont générés par des enzymes spéciales et non encodés par des gènes (comme bactérie)
Vrai ou faux; L’ARN peut parfois être sous forme de double-brin à l’intérieur de la cellule.
Faux, jamais à l’intérieur de la cellule.
Expliquez les quatre étapes principales du mécanisme général de l’interférence de l’ARN. Voir diapo 42.
1- Complexe d’ARN silencieux introduit
2- Va modifier la structure de la chromatine autour de la région complémentaire
3-Ré-introduction d’un complexe d’ARN silencieux
4- Soit match partiel= inhibition de la traduction
Soit match parfait= Dégradation
Vrai ou faux; Chez les eucaryotes, l’ARN codant est plus petit dans n’importe laquelle des sections de l’ARN.
Faux, l’ARN codant est plus long (structure épingle à cheveux).
Quel est l’impact d’avoir un ARN codant plus longs chez les eucaryotes?
Cela mène à deux clivages successifs.
Que représente le bout de la structure ‘‘Épingle à cheveux’’ de l’ARN?
Représente un espace entre les nucléotides complémentaires.
Qui est responsable de déterminer la spécificité de Drosha?
La jonction simple brin/double brin.
Quel est le rôle de Drosha?
Clive l’ARN dans le noyau.
Qu’est-ce qui arrive avec le clivage avec Drosha?
L’ARN double-brin est exporté dans le cytoplasme (Dicer agit).
Comment est-il possible d’utiliser RNAi au laboratoire?
- Cible des gènes précis
- Permet de diminuer l’expression des gènes
- Permet de cibler des familles de gène
Nommez deux niveaux de contrôle de transcription.
- Accessibilité de l’ADN
- Méthylation de la cytosine
En quoi consiste l’accessible de l’ADN ?
- État +/- condensé de l’ADN
- Empêche la fixation de la machinerie de transcription
En quoi consiste la méthylation de la cytosine ?
- Bloque la transcription
- Transmission aux cellules filles
- Change selon le type cellulaire
Vrai ou faux.
La densité de l’ADN ou son niveau d’empaquetage n’a aucun impact sur la transcription.
Faux, a un impact important sur l’accessibilité de l’ADN, ce qui est directement lié à la transcription
Quelles sont les structures non permises à la transcription? Dimension ?
- Fibre de 30-nm (30-nm chromatin fiber) = 30nm
- Domaine en boucle (Looped domains) = 300nm
- Chromosome dupliqué, hautement condensé = 1400 nm
- Hétérochromatine = 700nm
VOIR DIAPO 5
Quelle est LA seule structure permise à la transcription ? Quelle est sa dimension ?
Collier de perles (nucleosomes (beads on a string)] = 10 nm
Et ADN double brin = 2nm (pas observé un vivo, mais in vitro)
Vrai ou faux.
Le nucléosome est composé d’histones.
VRAI
Comment nomme-t-on les modifications qui affectent la condensation de l’ADN ?
Modifications épigénétiques
Vrai ou faux.
Les histones sont chargées négativement.
Faux, elles sont chargées positivement
Les modifications qui augmentent les charges positives …
… stabilisent la chromatine
Les modifications qui diminuent les charges positives …
… déstabilisent la chromatine
Comment il est possible de décondenser l’ADN ?
En changeant la charge, plus les mêmes interactions
En quoi consiste des histones ?
- Octamères : Plus précisément un trétramère de digères
- La partie N-terminale est accessible aux protéases, stabilise l’enroulement de l’ADN autour de l’octamère, présence de queues des histones.
Vrai ou faux.
C’est toujours les mêmes histones qui interagissent ensemble.
Vrai
L’histone H2A interagit avec quelle(s) autre(s) histone(s) ?
H2B
L’histone H3 interagit avec quelle(s) autre(s) histone(s) ?
H4
L’histone H2B interagit avec quelle(s) autre(s) histone(s) ?
H2A
L’histone H4 interagit avec quelle(s) autre(s) histone(s) ?
H3
En quoi consiste l’histone H1 ?
- Ne fait pas partie du noyau d’histone
- Se lie à l’ADN «linker» (linker histone)
- Compacte plus (+) l’ADN : Formation de la fibre de 30nm
Vrai ou faux.
Il faut d’abord retirer H1 avant de décondenser l’ADN
Vrai
Qu’est-ce qu’une modification épigénétique ?
- Affectent l’expression des gènes
- Pas transmissible à la prochaine génération
- Affecter par l’environnement
Quelles sont les deux formes de chromatine ?
- Euchromatine
2. Hétérochromatine
Qu’est-ce que l’euchromatine ?
- Actif
- Condensation légère
- Histones sont hyperacétylée et hypométylée
- Correspond à la région où les gènes sont transcrits
Qu’est-ce que l’hétérochromatine ?
- Condensation prononcée
- Peu de gènes transcrits (mais cela ne veut pas nécessairement dire qu’ils ne sont pas important)
Quelles sont les trois types de modification qui affectent les histones ?
- Méthylation des histones
- Acétylation des histones
- Phosphorylation
(voir diapo 12)
En quoi consiste la méthylation des histones ?
- Réprime généralement la transcription d’un gène
- La méthylation attire des protéines et stabilise l’ADN
- Sur Arginine (R) et Lysine (K) seulement
- Rend la molécule plus hydrophobes
- Attire des protéines à chromodomaine.
Qu’est-ce que les protéines à chromodomaine favorisent (méthylation) ?
Favorise la formation d’hétérochromatine (la forme la plus compacte de l’ADN)
Comment la méthylation des histones réprime la transcription d’un gène ?
En stabilisant l’ADN
En quoi consiste l’acétylation des histones?
- Modifie (diminue) la charge nette positive des histones et donc l’affinité de ces dernières pour l’ADN facilitant l’accès des facteurs de transcriptions.
- Les groupement acétyles favorisent le recrutement de protéines à bromodomaines.
- Ajouter sur des lysines seulement (K)
Qu’est-ce que l’hypoacétylation ?
Régions du génome où il y a peu de transcription
En quoi consiste les protéines a bromodomaines (acétylation)?
Ces protéines empêchent la formation de la fibre de 30nm (hétérochromatine) et permet à l’ADN de rester accessible
D’où provient le groupement acétyle ?
De l’acétyl-CoA
Comment s’effectue l’ajout d’un groupement acétyle sur les histones ?
Par l’entremise des acétylases
Comment s’effectue la perte d’un groupement acétyle sur les histones ?
Déacétylases
Vrai ou faux.
L’ajout ou la perte d’un groupement acétyle sur les histones est une réaction irréversible.
Faux, il s’agit d’une réaction réversible
En quoi consiste la phosphorylation des histones ?
- Le phosphate (PO4, charge -) diminue la charge positive des histones, ce qui favorise un relâchement ADN/histones
- S’effectue sur la sérine (S) et la thréonine (T)
Comment l’acétylation des histones active la transcription d’un gène ?
L’acétyl est ajouté (et retiré) des résidus lysines
Comment est-ce que la modification des histones affecte-elle leur fonction ? Expliquez
- Acétylation et phosphorylation : Réduit la charge nette positive des queues d’histones
- Perte de charge positive : Réduit aussi l’interaction avec l’ADN
- Réduit aussi la capacité de former une chromatine (à un niveau supérieur de condensation ) : Fibre de 30nm
Qu’est-ce qu’influence le remodelage de la chromatine ?
Est influencé par les modifications d’acétylation, de la méthylation et la phosphorylation
Que veut dire HAT ? Expliquez
Histone acétyl transférase : Décondensation de l’ADN = Activation de la polymérase
CpG méthylé est présent en …
absence de transcription
CpG non-méthylé est présent lorsqu’il y a une …
possibilité d’être transcrits
En quoi consiste la méthylation de l’ADN chez les eucaryotes?
- Semble jouer un rôle très important dans la régulation des gènes inhibant la transcription
- Catalysée par des enzymes appelés ADN cytosine-5-méthyltransférases (DNMTs)
Quelles sont les conséquences de la méthylation de l’ADN?
- De façon direct = inhibe la transcription
- De façon indirect = Peut déclancher la transcription d’autres gènes (exception)
En quoi consiste la méthylation des cytosines îlots CG ?
- Ne sont pas égales dans tous les groupes eucaryotes (protistes, champignons, plantes et animaux)
- Le di-nucléotide CG n’est pas distribué également dans tout le génome (21% de la représentation attendu)
- État des îlots est maintenu pendant la réplication
- Mécanisme détaillé n’est pas encore vraiment connu
Où se situe la méthylation des cystosines îlots CG ?
- Se situent principalement dans les régions 5’ des promoteurs, les régions non traduites et l’exon 1 (pour environ 40% des gènes des mammifères)
Quelle est la particularité des méthylation des îlots dans les régions 5’ des promoteurs ?
- Associé avec la transcription des gènes en aval
- Méthylation inhibe directement la transcription des gènes
Vrai ou faux.
Récemment des approches globales du génome (genome wide) ont confirmées un rôle de la méthylation dans l’expression des gènes tissus-spécifiques.
Vrai
Décrire le mécanisme pour la répression des gènes par la méthylation de l’ADN.
VOIR DIAPO 26
- La méthylation des CG empêche la liaison des facteurs de transcription à leurs sites de reconnaissance
- Est donc véritable et maintenu d’une génération à l’autre
Quel autre mécanisme la méthylation de l’ADN régule-t-elle ?
Imprinting
Qu’est-ce que le mécanisme imprinting ?
- Un organisme diploïde contient deux copies de chaque gène
- Comme ils ont des régions régulatrices quasi-identiques ils sont généralement tous deux exprimés.
- Par contre, dans certains cas, un gène est exprimé, l’autre non, c’est contrôler par l’imprinting.
Vrai ou Faux: La phosphorylation des histones s’effectue sur les Adénines.
Faux : Sur les Sérines et thréonines
Quel est l’effet qu’aura la sur-expression d’une histone déacétylase sur la transcription génique?
Ça diminuera la transcription
Quel est l’effet de la phosphorylation des histones?
Cela augmente la transcription
Vrai ou Faux: Les enhancers peuvent activer la transcription seulement s’ils sont en amont du gène
Faux: en amont ou en aval
Quel mécanisme de régulation régule négativement la transcription en empêchant/limitant l’accès à l’ADN par les facteurs de transcriptions?
La méthylation de l’ADN
Quelles sont les techniques possibles d’utiliser pour purifier l’ARN?
- La technique du Northern
- La technique du Northern-Blot
- La technique du RT-PCR
- La technique du qRT-PCR
- La technique du Microarray
- La technique d’hybridation in situ
- La technique du gène rapporteur
En quoi consiste la technique du Northern?
- Extraction de l’ARN de deux tissus à comparer
- Faire migrer l’ARN en fonction de leur taille par électrophorèse
- Transfert de l’ARN sur un surface (ex. papier) et fixation par chaleur ou rayon UV
- Ajout de nucléotides radioactifs
- Visualisation de l’ARN sur un film de rayon-x
Quels sont les avantages et désavantages de la technique du Northern?
Avantages:
- Permet de savoir si un gène est exprimé dans un tissus
- Donne une bonne quantité d’ARN total
Désavantages:
- Peu quantitative
- Nécessite l’utilisation de 32P (Radioactivité)
- Très long (1 gène par semaine)
À quelle question permet de répondre la technique du Northern?
Ce gène est-il exprimé dans ce tissus?
En quoi consiste la technique du Northern-Blot?
C’est la même chose que le Northern, mais les résultats sont quantifiés à l’aide du comptage des pixels
En quoi consiste la technique du RT-PCR?
Étape 1: Extraire l’ARN
Étape 2: Obtenir un cADN (ADN complémentaire à la séquence d’ARN) à l’aide d’une reverse transcriptase
Étape 3: Digestion du duplex ARN/ADN
Étape 4: PCR
Quelle amorce utilise-t-on pour faire la PCR de l’ARNm dans la technique du RT-PCR?
Des amorces de TTTTT (pour lier la queue poly-A et faire de l’ADN complémentaire)
Quels sont les avantages et désavantages de la technique du RT-PCR?
Avantages:
- Rapide (Plusieurs milliers d’ARN par semaine)
- Peu dispendieux (relatif)
- N’implique pas de 32P (radioactivité)
Désavantages: Résultats aussi peu quantitatifs que le Northern
En quoi consiste la technique du qRT-PCR?
Étape 1: Extraire l’ARN
Étape 2: Obtenir un cADN à l’aide de la reverse transcriptase
Étape 3: Digestion du duplex ARN/ADN
Étape 4: PCR quantitatif à l’aide de molécule fluorescentes
Quels sont les avantages et désavantages de la technique du qRT-PCR?
Avantages: Très quantitatif
Désavantages: Plus cher
En quoi consiste la technique du Microarray?
Étape 1: Préparer une lame avec un séquence spécifique à chaque gène du génome (probes)
Étape 2: Extraire les ARN et marquer les cADN avec des molécules fluorescentes (2 tissus/conditions - Cancer (rouge) et normal(vert))
Étape 3: Hybrider avec la lame avec les cADN marqués
Étape 4: Mesurer la fluorescence avec un laser
Quels sont les avantages et les désavantages de la techniques du Microarray?
Avantages: Donne un résultat pour tous les gènes du génome
Désavantages:
- Assez dispendieux
- Analyse complexe
- Peu quantitatif
- Donne un résultat pour tous les gènes du génome (doit purifier le gène rechercher par la suite)
À quelle question la technique du Microarray permet-elle de répondre?
Permet de savoir dans quel tissus et à quel moment dans le tissus les gènes sont exprimés
En quoi consiste du technique d’hybridation in situ?
On hybride une coupe du tissu avec une sonde marquée
À quelle question la technique d’hybridation in situ permet-elle de répondre?
permet de savoir où et quand dans le tissu le gène est exprimé et non seulement dans quel tissu
Quel est le désavantage de la technique d’hybridation in situ?
Assez long, donne une réponse pour un seul gène à la fois
En quoi consiste la technique du gène rapporteur?
C’est un gène témoin codant pour une protéine d’activité ou de propriété connue
Donnez 3 exemple de gène rapporteur.
- La luciférase qui produit de la lumière
- GFP (et dérivés) qui est fluorescente
- Le gène uidA qui code pour glucoronidase (GUS) une protéine qui convertit son substrat en un précipité bleu
Que se produit-il si on utilise GUS pour mesurer l’activité du promoteur?
On visualise l’activité de GUS sous le contrôle du promoteur que l’on étudie. Donc on obtient de l’information sur l’endroit et le moment où notre gène est exprimé
Qui a découvert la GFP?
Martin Chalfie
De quoi est extrait le GFP?
Ce gène est isolé à partir du «jellyfish» (méduse) Aequorea victoria et code pour une protéine qui une fois exposée à des rayons à 485nm, produit de la fluorescence
Quels sont les avantages du GFP?
- Pas besoin de tuer les cellules ou les animaux pour le détecter
- L’émission de lumière fluorescente ne requiert pas de co-facteur, de substrat ou d’un autre produit protéique
- Structure qui le rend stable à divers traitements
- Émission de fluorescence prolongée, même sous l’action de laser
- Existe en plusieurs couleur
- On peut voir la protéine en temps réel
