Real Time-PCR

Question 1

Real Time-PCR.

Answer 1

Variante da PCR convencional. Facilita a quantificação da expressão gênica em determinado tecido ou amostra.

Question 2

Princípio da Técnica

Answer 2

• Duplicação de cadeias de DNA;
• Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.
  + Precisão
  + Reprodutibilidade
  + Velocidade;
• 2 a 3 horas para emitir o resultado;

Question 3

RT - qPCR

Answer 3

PCR Quantitativo em Tempo Real

Question 4

Desnaturação

Answer 4

Separação da dupla fita de DNA;

Question 5

Anelamento ou Hibridização

Answer 5

Os iniciadores ou primers se ligam a fita de DNA que se pretende amplificar. São eles que irão identificar/marcar qual trecho de interesse do DNA deverá ser copiado;

Question 6

Extensão ou polimerização

Answer 6

A Taq-polimerase se liga a fita sinalizada pelo primer, complementando-a. Formando novamente uma fita dupla de DNA;
Esse ciclo é realizado inúmeras vezes;

Question 7

Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em?

Answer 7

Eletroforese em gel de agarose.
- Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado;

Question 8

qPCR

Answer 8

• Resultado é visualizado imediatamente;
• São adicionadas sondas fluorescentes às reações de PCR;
• A medida que o DNA é amplificado, o nível de fluorescência cresce
  proporcionalmente;
• Permite determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original;
• Pode ser um teste qualitativo ou quantitativo;

Question 9

Interferentes na Técnica

Answer 9

+ sensibilidade
+ sensivel a interferências

Question 10

Onde é realizada a técnica de RT-PCR?

Answer 10

Termociclador

Question 11

Principais Corantes Fluorescentes?

Answer 11

SYBR Green
TaqMan

Question 12

SYBR Green

Answer 12

• Intercalante na fita de DNA;
• Emite grande fluorescência após se ligar a DNA dupla fita;
• Mais barato;
• Inespecífico;
• Necessário adicionar um passo a mais nas análises;

Question 13

Temperatura de melting no SYBR Green

Answer 13

Definida como a temperatura na qual metade dos fragmentos de DNA está na forma desnaturada;
O fragmento de DNA depende do seu tamanho e da sua proporção entre G/C e A/T;
Não é dependente da concentração de DNA na reação, vai mudar a intensidade da fluorescência;
Dímero de primer tem TM menor que os fragmentos alvo;
Dois picos de TM = contaminação;

Question 14

TaqMan

Answer 14

• Oligonucleotídeo de sequência específica;
• Múltiplas fluorescências de uma só vez;
• Mais caro;
• Apresentam uma substância capaz de absorver a energia luminosa emitida pelo equipamento
  e dissipá-la na forma de luz e calor, em comprimento de onda diferente do original;
• Exige uso de uma sonda = Oligonucleotídeo de sequência específica;
• São agentes fluorescentes que permitem a monitoração da amplificação em tempo real;

Question 15

Molecular beacons

Answer 15

Oligonucleotídeos usados como sondas de fita simples que formam uma estrutura secundária entre as extremidades 5’ e 3’, chamada de haste e loop;
# Não emitem fluorescência quando estão livres em solução;
# Quando hibridizam com a fita de DNA contendo a sequência-alvo, as sondas assumem uma mudança conformacional tornando-a capaz de emitir fluorescência;