Rappels méthodologiques de biologie moléculaire et cellulaire

Question 1

Qu’est que le Southern et Northern blot ?

Principe ?

Quelle particularité liée à la structure de l’ARN ? qu’utilise-t-on pour y palier ?

Answer 1

• Southern blot et Northern blot : électrophorèse pour respectivement ARN et ADN
• Electrophorèse des acides nucléiques, qui sont chargés négativement, dans un champ électrique. Ils migrent dans un gel d’agarose (dérivé d’algue) à pH constant, l’agarose agissant comme un tamis. Plus les acides nucléiques sont longs plus ils ont du mal à migrer. Donc distance de migration inversement proportionnelle à la taille
• ARN ont naturellement des structures secondaires et tertiaires : ils ont tendance à former des boucles. On rajoute dans le gel de la formamide pour défaire les boucles et linéariser les ARN.
  ADN lui est linéaire.

Question 2

Qu’est ce que le milieu de charge ?

Que peut-on mettre dans le gel pour visualiser les acides nucléiques ?

Comment fait-on pour évaluer le poid moléculaire ?

Answer 2

• Milieu de charge = glycérol + bleu de xylène. Cela permet de voir si on a chargé au bon endroit, d’être sûr que ça tombe au fond du puit, de voir où les AN ont migré. On peut aussi utiliser du bleu de bromophénol.
• Dans le gel on peut mettre du bromure d’ethidium (intercalant AN mais cancérigène donc n’est plus utilisé aujourd’hui). Ceci permet de voir les AN après mise sous lumière UV.
  Aujourd’hui on utilise des intercalants moins cancérigènes comme le SYBR Green. Se regarde sous lumière bleue.
• Migration des AN selon leur poids moléculaire en kilobases : on utilise un mélange d’AN témoins dans un des puits (tailles de référence, connues) qui migrent donc à certaines distances selon leur poids en kilobases, et on se sert de cette migration comme échelle. Comme ça on peut avoir une idée de la taille de nos AN d’intérêt qui ont migré
  Pour les ARN on se sert des ARN de référence S28 et S18, ce sont des ARNt (aides à la traduction). On utilise le ratio 18S/28S pour évaluer la dégradation de l’échantillon. Echantillon dégradé : 28S très bas et 18S haut.

Question 3

Qu’est ce que le blotting ?

Quelle méthode ?

Answer 3

• Le travail sur gel directement n’est pas possible, il faut donc transférer les AN sur une autre surface = Blotting.
• Gel où ont migré les AN est dénaturé dans un bain de soude. Puis on transfère les AN grâce à un système de presse/sandwich avec de bas en haut : Solution de tampon avec support/papier filtre + gel agarose (celui de l’électrophorèse) + membrane nylon + papier filtre encore + papier absorbant au-dessus et on met sous presse. Par capillarité le tampon diffuse vers le haut, le flux de liquide emporte les AN qui eux vont se coller sur membrane en nylon en remontant.

Question 4

Comment reconnait-on ensuite les séquence d’intérêt ?

Answer 4

Les AN sont donc transférés sur un support inerte de nitrocellulose/amidon sur lequel des sondes pourront être hybridées pour une séquence d’intérêt.

Question 5

Quelles caractéristiques de la sonde ? (2)

A quoi peut être couplé la sonde ?

Qu’est que l’hybridation in situ ?

Qu’est ce que les puces ADN ?

Answer 5

• Donc la sonde est monobrin.
• Une sonde doit être d’au moins 20 bases pour être spécifique de la séquence d’intérêt

La sonde est couplée :

• Soit à un fluorophore
• Soit à un marqueur radioactif : Thymidine tritiée
• Soit couplée à une enzyme : HRP
• Hybridation in situ : sonde marquée fluorescente sur une coupe de tissu directement (cellules/tissu fixés)
• Puces ADN : sondes immobilisées sur une puce dans des puits.

Question 6

Quelles sont les étapes de laPCR ? (Polymeras chain reaction)

Quelle est la particularité de la TAQ polymérase ?

Answer 6

• Dénaturation à 95 degrés pour obtenir ADN simple brin.
• Hybridation avec primer/sondes spécifiques complémentaires de séquences d’intérêt. Baisse de la température nécessaire pour hybridation.
• Phase extension/amplification/élongation à 70 degrés par ajout de polymérase.
• 20 à 30 cycles nécessaires pour amplification correcte. Il existe des primer sens (spécifique séquence intérêt) et antisens (spécifique autre sens de la séquence d’intérêt) qui attirent les polymérases. A chaque cycle on dénature pour obtenir des simples brins, à chaque cycle nouvelle fixation des primers et nouvelle synthèse des séquences complémentaires par polymérase
• Découverte de la Taq polymérase qui fonctionne aux alentours de 70 degrés, a été trouvée dans des bactéries vivants dans des sources chaudes. Evite de devoir remettre des polymérases « classiques » qui ne fonctionnent qu’à 37 degrés à chaque cycle d’amplification

Question 7

Quelle étape nécessaire si on veut répliquer des ARNm ?

Par quelle méthode ?

Answer 7

Si on souhaite étudier les ARNm :
- Nécessité de les convertir en ADNc d’abord car les ARNm sont très fragiles. On pratique une étape de rétrotranscription avec une reverse transcriptase (d’origine virale) qui permet une synthèse d’ADNc à partir d’ARNm. Les ADNc sont plus stables.

• Les ARN matures possèdent une queue polyA en 3’. On utilise comme primer un polyDT qui se fixe sur la queue polyA et permet d’amorcer la rétrotranscription (polyDT sert de support à la reverse transcriptase) pour création du brin complémentaire. Ensuite le tout est mis à pH basique pour détruire les ARNm et garder seulement les ADNc dans la solution.

Question 8

2 méthodes de PCR quantitative ?

Answer 8

• SYBR green
• TaqMan

Question 9

Principe de fonctionnement du SYBR green ?

Answer 9

• Fluorescent, intercalant de l’ADN, se lie aux ADN double brins, mais peut aussi lier des produits non spécifiques (si primer pas assez spécifique se fixe par erreur sur mauvais AN et on amplifie des choses non voulues qui seront fluo). Il est donc nécessaire de réaliser des pics de dissociation = faire manipulation de dénaturation qui permet d’obtenir des pics de fluo (AN relâchent le SYBRgreen plus ou moins vite selon leur taille), il faut en théorie qu’il n’y ait qu’un seul pic (la séquence d’intérêt amplifiée).

Question 10

Principe du TaqMan ?

Answer 10

Taqman est une méthode plus spécifique mais plus complexe, elle fait intervenir deux sondes :
- La sonde primer/amorce qui se fixe sur le début de la séquence d’intérêt
- La sonde Taqman qui possède
o Un fluorochrome émetteur
o Un neutralisant = quencher. Si le fluorochrome émetteur et le quencher sont à coté le quencher absorbe la fluorescence de l’émetteur et la ré-émet sous forme de chaleur. Il n’y a donc pas de fluorescence.
o Une sonde reconnaissant la partie centrale de la séquence d’intérêt (hybridation)

La Taq polymérase est ensuite introduite dans le milieu :
- Elle possède son activité de synthèse d’ADNc (à partir du primer)
- Elle possède également une activité 5 exonucléase
Quand la Taq polymérase arrive au niveau de la sonde Taqman, elle utilise sa fonction 5-exonucléase pour séparer le quencher et l’émetteur par clivage. Donc elle clive le fluorophore émetteur, elle le libère et cela lui permet d’émettre sa fluorescence (car il est alors éloigné du quencher). La fluorescence montre donc que la réaction de synthèse d’ADNc a bien eu lieu et cette fluorescence peut être mesurée ensuite.

Question 11

Détection de la fluorescence à chaque cycle :

Quel est le seuil de détection ? (nombre de copies nécessaire à la détection)

S’il y a initialement 1 seule copie, combien de cycle faut-il pour atteindre la détection ?

Qu’appel CT ?

Answer 11

• Le seuil de détection est à peu près de 10^10 copies
• Entre deux points = entre chaque cycle, la quantité de fluorescence est multipliée par 2. Il faut mesurer au bout de combien de cycles d’amplification la fluorescence franchit le seuil de détection.
  Si une seule copie de la séquence d’intérêt est présente dans l’échantillon il faudra 33 cycles pour détection (1 multiplié par deux puis deux copies multiplié par deux et ainsi de suite 33 fois).
• CT = seuil du début de phase exponentielle.

Question 12

A combien de cycles sont détectables les ARN de charge 18s ?

Quelle conclusion si fluorescence à 36 ou 38 cycles ?

Answer 12

• Pour ARN « de charge » comme ARN 18S, détection dès 6 à 8 cycles d’amplification car présence de nombreuses copies de cet ARN dans un même échantillon.
• Si fluorescence survient au bout de 36 ou 38 cycles alors on ne peut pas la considérer comme significative car elle survient trop tard, on a probablement amplifié un contaminant

Question 13

Qu’est ce que le Chip Hydridization ?

Limites ? (2)

Answer 13

ADNc sont marqués par fluorescence. On peut mettre des fluorochromes de couleurs différentes pour visualiser des ADNc différents sur une même puce :

• Par exemple comparaison des AN de deux types cellulaires différents (saines vs cancéreuses)
• Autre exemple comparaison des AN de cellules sans traitement d’une couleur vs cellules avec traitement d’une autre couleur

On met les AN sur une plaque avec plein de puits. Dans les puits sont placées des sondes avec des séquences complémentaires des séquences d’intérêt, différents puits ont des sondes différentes. Les ADNc d’intérêt s’y fixent, on lave pour enlever ce qui ne s’est pas fixé, et on évalue la fluorescence. L’hybridation est proportionnelle à la quantité d’ADNc d’intérêt présent dans l’échantillon.

Limites :
Les sondes doivent être très spécifiques
- Ne permet de détecter que des choses connues.

Question 14

Western blot :

Principe de base de détection ?

Answer 14

Electrophorèse des protéines obtenues après broyats sur un gel de polyacrylamide dans un champ électrique puis transfert sur membrane et détection des protéines d’intérêt par anticorps et mise en évidence de l’anticorps via signal visible.

Question 15

Le gel :

Comment faire varier la taille des mailles ?

Answer 15

Le gel possède des mailles de taille définie. Le gel est réticulé, il peut être préparé avec acrylamide et bis acrylamide qui crée des ponts entre chaînes d’acrylamide. On ajoute du persulfate ammonium et du TEMED (qui est toxique) qui catalyse la polymérisation du gel. En faisant varier le pourcentage d’acrylamide dans le gel on peut faire varier la taille des mailles donc le pouvoir de séparation du gel. Les grosses protéines restent en haut et migrent peu alors que les petites migrent loin, plus bas. Les gels peuvent être achetés prêts. Par exemple un pourcentage à 10% permet une gamme de séparation optimale entre 22 et 300 kDa ; alors qu’un pourcentage à 15% a un pouvoir de séparation optimale pour des protéines plus petites entre 2,5 à 100 kDa.

Question 16

Quelle modification doit avoir lieu sur les protéines pour pouvoir les faire migrer ?

Quel élément casse les liaisons entre les protéines ?

Answer 16

• Les protéines possèdent des charges négatives positives ou sont neutres, elles possèdent une conformation spatiale. Or on veut les faire migrer dans un champ électrique donc elles doivent toutes être négatives. On utilise le SDS (SDS = détergent anionique fort) qui se lie aux acides aminés pour donner des charges négatives à toutes les protéines, le SDS déplie aussi les protéines.
• La structure tertiaire des protéines est dépliée par le SDS, tandis que les ponts disulfures entre les protéines sont cassés par le bêta-mercapto-ethanol. Casse aussi les ponts disulfures entre les différentes sous unités de protéines.

Question 17

Quelle coloration possible après migration des protéines ?

Quel problème après cette coloration ?

Answer 17

• Gel vertical en forme de plaque avec plusieurs puits au sommet pour mettre ses échantillons dedans. Bleu pour voir où on a chargé (+ voir fond de migration) et glycérol pour que l’échantillon aille bien au fond du puit. Quand l’échantillon a migré on peut colorer au bleu de Coomassie pour voir où s’arrête la migration : mais empêche de faire des manipulations après. On utilise comme échelle un échantillon contenant des protéines de tailles connues : certaines donnent même des bandes colorées pour se repérer. La coloration colore donc toutes les protéines qui ont migrées et pas seulement celle qui nous intéresse.

Question 18

Comment se déroule le transfert après la migration ?

Answer 18

Sur une membrane de cellulose (sensiblement même technique que blotting)
- Ou on effectue un transfert en milieu liquide dans un champ électrique, cf figure ci-dessous. Les protéines vont du gel vers une membrane (gel + membrane de transfert + papier absorbant + « éponges » le tout dans un champ électrique).
Attention : Si Bleu de Coomassie a été utilisé pour marquer le gel les manipulations de transferts ne peuvent pas être faites.

Question 19

Comment détecte-t-on la protéine d’intérêt ?

Quelle précaution vis à vis de la membrane ?

Answer 19

• On peut détecter la protéine avec l’anticorps spécifique de la protéine.
  On ajoute l’anticorps primaire contre la protéine d’intérêt (hybridation prend une nuit).
  Puis détection de l’anticorps primaire en ajoutant un anticorps secondaire dirigé l’anticorps primaire (exemple si anticorps primaire issu de souris on utilise un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de souris). L’anticorps secondaire est lié à une enzyme.
  On incube ensuite le tout avec le substrat de l’enzyme. Une fois le substrat en contact avec son enzyme la réaction chimique émet de la lumière qu’on pourra détecter.
  Par exemple l’anticorps secondaire peut être lié à l’HRP (peroxydase du radis noir), son substrat est le luminol. Si on rajoute de l’eau oxygéné dans le milieu, l’HRP clive le luminol (introduit au préalable) qui émet alors de la lumière. La lumière peut marquer d’une bande un film placé au-dessus ==
• Le problème c’est que la membrane après le transfert peut lier des anticorps de façon non spécifique, il faut donc saturer la membrane avec par exemple une solution de BSA 5% ou de la caséine (régilait).

Question 20

Comment vérifier la spécificité de l’anticorp utilisé ?

Answer 20

• A prendre en compte pour le Western Blot : la spécificité de l’anticorps utilisé. Souvent l’anticorps reconnaît en fait plusieurs protéines, ce qui fausse les résultats. Les entreprises vendent donc des anticorps « KO validated ». Dans une une lignée cellulaire KO pour la protéine d’intérêt, on prend un broyat de cellules. Ce broyat est passé en western blot et on ajoute l’anticorps contre la protéine d’intérêt. S’il n’existe aucune bande visible sur le western blot alors cela signifie que l’anticorps est spécifique. On peut le vérifier soi-même avec des siRNA dirigés contre la protéine intérêt : bande du WB doit disparaitre.

Question 21

Quelles étapes pour isoler et mettre en culture des cellules ?

Answer 21

Plusieurs étapes :

• « Emincer » le tissu au scalpel pour avoir des cubes d’un millimètre cube
• Digestion du tissu : dissociation des liaisons fortes entre les cellules par mécanisme de broyage/vortexage ou par mécanisme enzymatique plutôt (rate plus facile que poumon)
• Mise en culture : culture primaire.
• Toutes les cellules ne prolifèrent pas aussi facilement, importance du milieu de culture, sera plus ou moins complexe selon le type de cellules qu’on veut cultiver.
• Repiquâge (fibroblastes poussent très bien en culture alors que d’autres ne peuvent pas être repiquées : une fois que collées au fond de la boite si on les enlève pour les mettre dans une nouvelle boite elles ne poussent pas).

Question 22

Comment connait-on le milieu de culture d’une cellule ?

Quelles cellules sont faciles à cultiver ?

4 types de cultures différentes ?

Answer 22

• Milieu de culture : connaissances empiriques, se renseigner dans la littérature sur quel milieu a déjà été utilisé pour cultiver le type cellulaire choisi.
• Facile à cultiver : Cellules circulantes, moelle osseuse, liquide pleural, cellules de cordon.

Différents types de cultures :

• Cellules en suspension : pour cellules non adhérentes
• Couche mono cellulaire : pour cellules adhérentes type fibroblastes
• Avec lignée feeder : pour les cellules souches par exemple. Les cellules souches ne peuvent pas pousser seule elles ont besoin d’une coculture avec lignée feeder (fibroblastes dont la prolifération est bloquée).
• Milieu semi solide : par exemple cellules tumorales dans un milieu d’agar, utilisation de méthylcellulose pour voir la croissance tumorale.

Question 23

Arrive à confluence en quel délai ? Quel concentration ?

Que se passe-t-il à confluence ?

Answer 23

• Division en 25 à 30h, nécessité de changement de milieu de culture tous les 2 à 3 jours.à confluence (10^5/cm2)
• Après confluense les cellules se détachent et meurent. Donc il faut les récupérer avant. Attention les cellules peuvent changer de phénotype quand elles arrivent à confluence. Sauf si cellules transformées/cancéreuses qui elles ont perdu l’inhibition de contact ; les cellules transformées continuent de proliférer et forment des dômes.

Question 24

Conditions de culture classique ?

Answer 24

Milieux de culture : eau, ions, sucre, acides aminés, acide gras, souvent antibiotique malgré conditions de travail stériles pour éviter une éventuelle contamination.
Aussi ajout de sérum de veau foetal pour ses facteurs de croissance et aussi car il contient de la fibronectine (protéine de la matrice extra-cellulaire) qui se lie au plastique de la boite de culture et les cellules peuvent s’attacher ensuite sur cette fibronectine. Les cellules produiront ensuite leur propre matrice.

Question 25

Le plastique modifie-t-il le phénotype de la cellule par rapport au poumon ? pourquoi ?

Quelles conditions d’incubation ?

Answer 25

• La culture sur du plastique modifie le phénotype des cellules. La dureté (= Stifness) du poumon est d’environ 1 kilopascal (support relativement mou) alors que la dureté du plastique est d’1 Gigapascal (rigide). Exemple : fibroblastes sur plastique : fibres de stress très augmentées si comparées à des fibroblastes cultivés sur surface molle.
• Incubateur température à 37 degrés, CO2 réglé à 5%, dans une atmosphère humide avec hygrométrie 84-85%, avec un pH à 7,4 maintenu grâce à un milieu tampon.

Question 26

Comment visualise-t-on approximativement le pH ?

Answer 26

Dans le milieu de culture on met du Rouge phénol pour avoir une idée du pH de la culture :

• Normal : la culture est colorée en rose
• Si devient jaune alors les cellules ont consommé tous les nutriments et produisent des lactates qui acidifient le milieu qui devient alors jaune
• Si jaune trouble alors contamination avec bactéries
• Si violet : problème de CO2, pH trop basique

Poste de sécurité microbiologique : sur 100% de l’air qui passe le filtre 65% de l’air est filtré réutilisé et 35% est enlevé. Enceinte maintenue stérile, le filtre retient tout ce qui est de taille supérieure à 0,3 microns.

Question 27

Quelle méthode pour récupérer les cellues adhérentes ? (7)

Answer 27

Une fois que cellules adhérentes ont recouvert la boîte :

• PBS pour enlever le milieu de culture
• Rinçage du milieu sans calcium ou avec chélateur du calcium (car les cellules sont liées entre elles par des cadhérines qui ont besoin de calcium pour fonctionner)
• Trypsinisation avec Trypsine qui est une enzyme qui supprime les interactions cellules-plastique, donc les cellules s’arrondissent et se mettent à flotter
• On récupère les cellules qui flottent, ajout d’un sérum avec Alpha-1-antitrypsine pour bloquer la trypsine
• Centrifugation
• Décompte des cellules
• Bleu trypan : marque les cellules mortes car passe la membrane que si elle est percée, permet d’évaluer la viabilité cellulaire

Question 28

Comment appelle-t-on la limite de division des cellules ? A quoi est-elle liée ?

Answer 28

Hayflick limit : A chaque division cellulaire, les télomères se raccourcissent, quand ils deviennent trop courts il y a une activation de p53 puis de P21, ce qui entraîne un changement de phénotype ou l’entrée en sénescence/l’apoptose.

Phénomène de crise réplicative (crise M1) qui entraîne une entrée en sénescence

Homme : télomères relativement courts, 8 à 15 kilobases. Dans les cellules normales adultes il n’y a pas de télomérase (répare les télomères et les rallongent) contrairement aux cellules embryonnaires et aux cellules cancéreuses qui possèdent des télomérases.

Question 29

Quelles sont les 4 phases dans la culture primaire ?

Answer 29

• Phase de latence le temps d’adhérer
• Puis croissance exponentielle
• Puis état stationnaire
• Evolution vers la mort
  ➔ Donc à l’état stationnaire il faut les repiquer dans une autre boîte avec nouveau milieu.

Question 30

Qu’est ce que la crise M2 ?

Que faut-il pour éviter cela ?

Answer 30

• Les oncogènes peuvent « résoudre » cette crise M1 et la cellule continuera de se diviser infiniment.
• Le problème c’est que les télomères continuent eux de raccourcir à chaque division et ceci entraine des aberrations chromosomiques dont la cellule peut in fine mourir. On parle de crise M2.
• Donc pour rendre une cellule immortelle, il faut aussi lui faire exprimer la télomérase (infecter la cellule par adénovirus avec gène codant la télomérase). Ceci permettra de faire passer la crise M2 et de rendre la cellule immortelle.

Question 32

Une cellule immortelle est-elle cancérigène ?

Answer 32

Attention cellule immortalisée est différente de cellule tumorigène : une cellule immortelle ne meurt jamais car elle échappe à la sénescence, elle peut proliférer à l’infini, mais elle ne crée pas de tumeur c’est-à-dire que sa prolifération n’est pas anarchique.
Une cellule immortelle peut être repiquée au moins une cinquantaine de fois.

Question 33

Une lignée tumorigène peut-elle pousser seule ? Pourquoi ?

Que doit-on vérifier quand on achète une lignée ?

Answer 33

• Oui, Une lignée tumorigène est capable de pousser en milieu semi liquide en formant des colonies malgré l’absence de matrice extra-cellulaire car les cellules tumorigènes sécrètent leur propre matrice extra-cellulaire. Elles ont perdu leur inhibition de contact. Et si on injecte ces cellules à des souris immunodéprimées elles développent des tumeur.
• Il faut vérifier l’identité de la lignée : 20% des lignées vendues sont en fait contaminées par des cellules HeLa ou A549 (car ces deux lignées poussent vite et bien partout). Le site SANGER donne les caractéristiques attendues des lignées. Cette vérification passe par des marquages et des PCR (kits de vérification).

Question 34

Interface air-liquide :

Quelles étapes pour un épithélium respiratoire ?

Answer 34

• Par exemple culture 3D en interface air-liquide pour mimer l’épithélium respiratoire. Dans la boite de culture on ajoute une cuve, on obtient deux étages. Le fond de la cuve est une membrane permettant à certaines molécules de passer mais pas aux cellules (pores mesurent seulement 0,4 microns).

Premièrement on cultive des fibroblastes dans l’étage du bas avec du collagène ce qui recrée un stroma.

Deuxièmement à l’étage du dessus on cultive des cellules HBEC (cellules immortalisées d’épithélium respiratoire) en laissant le dessus à l’air libre.

On obtient après 3 semaines un épithélium respiratoire complet avec tous les types de cellules épithéliales, ciliées, à mucuc etc.

Question 35

Organes sur puces :

Principe ?

Answer 35

Puce avec canal central divisé par une membrane au milieu. Sur la membrane on cultive les cellules d’intérêt. Dans les deux compartiments du canal (d’un côté et de l’autre de la membrane) on peut mettre des milieux différents : par exemple air d’un côté et « sang » de l’autre.

On peut également imposer une tension à la structure pour mimer les mouvements respiratoires (car la structure est en PDMS qui est plutôt mou). Dans la réalité est assez difficile à mettre en place et couteux, il ne faut le faire que s’il y a une question précise.

Question 36

Organoïdes :

Answer 36

On cultive un bout d’organe (avec l’intégralité de ses types cellulaires) en milieu matrigel. Ceci permet aux cellules souches de proliférer. On peut ainsi obtenir tous les types cellulaires y compris ceux difficiles à obtenir en culture primaire. On peut extraire les types souhaités et ensuite les banquer et/ou les repiquer. Intérêt par exemple pour obtenir des pneumocytes de type II.