Quantificação de DNA por Espectrofotometria Flashcards
A lei de Lambert-Beer é sempre válida?
Não é válida para concentrações relativamente baixas.
Porque se dilui o DNA?
Por vezes é necessário diluir as amostras para que a concentração esteja dentro da gama dinâmica (Gama dinâmica: gama de concentrações para as quais o analito pode ser quantificado com uma curva de calibração linear)
Qual a função do Tris na tampão?
Melor reolução para framento maiore
Qual a função do EDTA?
Porque se usa uma cuvette de quartzo e não de plástico?
O plástico funciona apenas para espectro de luz visível, o quartzo também funciona para UV.
Porque se mede a absorvência a estes comprimentos de onda?
Os ácidos nucléicos têm seu pico de absorbância em 260 nm; as proteínas têm seu pico de absorbância em 280nm; 230nm é usado para medir contaminantes na amostra.
Subtrair aos valores de absorvência das amostras o valor de absorvência do tampão TE, para os vários comprimentos de onda. Porque se faz esta subtração?
Para ignorar a absorção de compostos que não são os compostos de interesse no tampão.
Determinou-se as razões A260/A280 e A260/A230 com base nos valores calculados.
Que informações fornecem estas razões?
As proteínas têm um máximo de absorvência nos 280 nm. Numa amostra pura de DNA a razão entre a absorvência a 260 nm e a absorvência a 280 nm (A260/A280) deverá ser de cerca de 1,8; se o valor for menor deverá haver
contaminação da amostra com proteínas. Numa amostra pura de RNA, esta razão deverá assumir valores próximos de 2.0. A contaminação com outros compostos orgânicos é avaliada através da razão entre a absorvência a 260 nm e a absorvência a 230 nm (A260/A230); em amostras
puras de ácidos nucleicos esta razão deverá assumir valores entre 2,0 e 2,2.
O espectro de absorção é a representação gráfica…
Da capacidade de absorção de electromagnética-absorvência- em função do comprimento de onda.
Os picos de absorvência das biomoléculas ocorrem em que gamas?
UV e visível.
O valor de absorvência é inversamente proporcional à concentração.
Verdadeiro ou Falso?
Falso.
O que é a Lei de Lambert-Beer?
Expressa a relação entre a concentração de uma molécula em solução
e a absorvência.
A absorvência dos ácidos nucleicos tem o seu pico em que valor?
260 nm.
Qual a função do EDTA?
O EDTA é um agente quelante de metais, desativando assim as atividades da nuclease e protegendo os ácidos nucleicos da degradação.
