Observação de estruturas subcelulares por imunocitoquímica e microscopia de fluorescência Flashcards
Que especificidades apresentam o anticorpo primário e secundário?
O anticorpo primário apresenta para a proteína de interesse.
E o anticorpo secundário está conjugado com o fluoróforo e tem afinidade para o anticorpo primário.
Qual o objetivo desta atividade experimental?
Determinar se a circularidade do núcleos de células humanas se altera como resultado de exposição ao H2O2, por observação por microscopia de fluorescência.
O que é importante ter em consideração durante a fixação?
Não permitir que as células sequem durante todo o procedimento.
Porque razão se fixam os tecidos?
Para parar todo o tipo de atividade celular e manter a estrutura da célula.
Para que serve o paraformaldeído?
Para fixar através do cross-linking entre moléculas.
Porque é necessário incubar as células com Triton -100?
Sendo uma espécie de detergente, este composto permite a permeabilização da membrana das células de forma a que os anticorpos não se liguem apenas superficialmente e consigam alcançar as proteínas de interesse.
Que cuidados a ter durante a manipulação das amostras?
Não adicionar soluções diretamente sobre as células e ter em conta sempre o lado da lamela onde elas se encontram.
Porquê usar PBS para lavar as lamelas?
O PBS é isosmótico. Se fosse usado água destilada, a pressão osmótica levaria à entrada de água na célula levando ao seu rebentamento.
Descreva uma característica do Parafilm.
Sendo hidrofóbico, permite a tensão ou seja, que o BSA fique só na lamelas.
Porque se realiza esta incubação com o BSA?
Porque se não corremos o risco de o anticorpo se ligar a locais inespecíficos, com o bloqueio o anticorpo só se liga à zona desejada. Assim outras proteínas ligam-se a estes locais de bloqueio.
Porque é necessário o cuidado de garantir que não há bolhas entre o parafilm e as lamelas?
As bolhas impedem o contacto dos anticorpos com as células.
Porque é necessário levar as lamelas depois da incubação com o anticorpo?
Para retirar os anticorpos primários que não se ligaram.
Porque se usam dois anticorpos (primário e secundário) e não apenas um conjugado com um fluoróforo?
Permite uma amplificação do sinal e é melhor em termos económicos.
Para que serve o DAPI?
Marca o DNA e permite-nos visualizar o núcleo.
