Quantificação de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometria de Absorção UV-Vísivel Flashcards
Porque se dilui o DNA?
Por vezes é necessário diluir as amostras para que a concentração esteja dentro da gama dinâmica
(Gama dinâmica: gama de concentrações para as quais o analito pode ser quantificado com uma curva de calibraçãolinear)
Porque se dilui o DNA em tampão TE e não em água?
O tampão TE evita a degradação dos primers através de vários congelamentos e descongelamentos que a água não pode fazer e o tampão TE é alcalino (DNA e RNA são relativamente estáveis em pH 8) e contém EDTA que ajuda na inativação de DNAses e RNAses.
Qual a função do Tris na tampão?
Melhor resolução para fragmentos maiores (?)
Qual a função de EDTA?
O EDTA é um agente quelante de metais, desativando assim as atividades da nuclease e protegendo os ácidos nucleicos da degradação
Porque se usa uma cuvette de quartzo e não de plástico?
O plástico funciona apenas para espectro de luz visível, o quartzo também funciona para UV.
Em que consiste este passo:
“Definir como branco”
É usado para definir o espectrofotômetro para ignorar a absorção de compostos que não são os compostos de interesse
Porque se mediu novamente os valores de absorvência do tampão?
Para substrair e retirar os componentes que nao sao de interesse
Porque se mede a absorvência a estes comprimentos de onda?
Os ácidos nucléicos têm seu pico de absorbância em 260 nm; as proteínas têm seu pico de absorbância em 280nm; 230nm é usado para medir contaminantes na amostra
