Protein exstraction Flashcards
Fortæl om detergent lysis
This is a common method for cell lysis, where detergents are used to solubilize the lipids and proteins in the cell membrane. Detergents work by having a hydrophilic (water-loving) head and a hydrophobic (water-fearing) tail, which allows them to interact with and dissolve the lipid bilayer of the cell membrane, leading to cell lysis.
hvad er og gør triton x
Det er ikke-ioniske detergent Triton X-100. Denne har til formål at gøre lipider og membranproteiner opløselige. Triton X-100 bidrager også til lysering ved at inkorporere sig i cellemembranen
hvad er og gør sds
Dette er en anionisk surfaktant, der denaturerer proteiner og gør dem opløselige. SDS medvirker til lysering af celler, da den ligsom Triton X-100 virker som detergent, og gør phospholipider opløselige.
Ødelægger proteinets sekundære og tertiære struktur. Dette medfører, at de fleste proteiner udfoldes til deres primære struktur, hvilket muliggør binding af SDS til aminosyrerne
Hvordan kan man fjerne dna og rna
hvad skal der bruges yderligere
Rnase. DNase I kræver divalente cationer, tilsættes mg2+ eller ca2+
fryse tø
Nedfrysning og optøning forårsager mekanisk stress på cellemembranen og iskrystaller på cellemembranen ved skiftevis udvidelse og sammentrækning
Mekanisk stress
Sonication, hvordan fungere det?
lydbølger, som laver trykændringer i opløsningen, under lavt tryk kommer der små gasbobler og under højt tryk kollapser boblerne og kendt som cavitation. under dette frigives energi , som genererer intens lokal varme og stærke hydrodynamiske forskydningskræfter, hvilket forstyrre cellmembranen.
hvordan undgår man under sonikation af proteiner denaturerer
ice bath or a thermostatic bath to help dissipate the heat
Hvad er formålet med et spin filter
Hvordan fungerer et spin filter
man kan separere molekyler baseret på deres størrelse afhængig af filter størrelse. Man har sin prøve og et filter, det bliver udsat for centrifugering, hvor prøven tvinges igennem filtret. De molekyler, der er større end porestørrelsen, tilbageholdes i prøvereservoiret.
Hvordan vælges membranfiltret i et spinfilter
De molekyler, der er større end porestørrelsen, tilbageholdes i prøvereservoiret. Hvis du ønsker at koncentrere et protein med en kendt størrelse, ville du vælge et spinfilter med en porestørrelse, der er mindre end størrelsen på dit protein.
hvordan udfører man frysetørring step 1 freezing
bruger flydende nitrogen. Frysning forhindrer dannelsen af store iskrystaller, der kan forstyrre proteinstrukturen. I stedet dannes der små iskrystaller, som er med til at bevare proteinmolekylernes integritet.
hvordan udfører man frysetørring step 2 subliminering
Efter frysning påføres et vakuum på den frosne prøve. Reduceret tryk gør at det frosne vand går fra et fast stof (is) til en gas (vanddamp) uden at passere gennem væskefasen. Denne proces fjerner isen fra prøven, hvilket effektivt reducerer vandindholdet.
hvordan udfører man frysetørring step 3
Temperaturen øges gradvist, og de resterende bundne vandmolekyler fjernes gennem desorption. Dette opnås ved at anvende en lidt højere temperatur og lavere vakuum sammenlignet med den primære tørrefase. Sekundær tørring sikrer fjernelse af eventuel resterende fugt fra proteinprøven, hvilket forbedrer dens langsigtede stabilitet og holdbarhed.
Hvordan anvendes salting out
Når saltkoncentrationen stiger, falder opløseligheden af proteiner. Dette får proteinerne til at gennemgå præcipitation eller aggregering. Den reducerede opløselighed skyldes primært konkurrencen mellem saltene og proteinerne om vandmolekyler, hvilket fører til svækkede protein-vand-interaktioner og efterfølgende proteinaggregering.
hvordan virker en centrifuge
separate components of a mixture based on differences in density or particle size.
Hvorfor bruge 3 forskellige LAB stammer
Nævn 3 grunde
Forskellige LAB-stammer kan have unikke metaboliske evner og præferencer for specifikke substrater.
Introduktion af flere LAB-stammer kan hjælpe med at skabe et konkurrencedygtigt miljø, der hæmmer væksten af uønskede mikroorganismer eller ødelæggende bakterier.
Forskellige LAB-stammer kan have forskellige ernæringsmæssige krav. Ved at bruge flere stammer kan du optimere udnyttelsen af forskellige næringsstoffer, der er til stede i fermenteringsmediet.
hvad kunne der være i LYSE buffer, som ikke er kompatibel med Qubit
SDS, Salts and Metal Ions, Tris-HCl Buffer, ethanol, phenol.
Hvad kan LYSE buffer indeholde
(nævn 5 ting)
Ionic Detergents: Examples of ionic detergents include sodium dodecyl sulfate (SDS). Nonionic Detergents: Commonly used nonionic detergents include Triton X-100, salt can assist in the release of cellular components. Buffer agent: tris - maintain pH.
Protease Inhibitors:
hvordan virker covaris sonikatoren
De højfrekvente lydbølger skaber skiftende cyklusser som reducere densiteten. kavitation, hvilket resulterer i dannelse og hurtig kollaps af små gasbobler i prøven. Dette fænomen genererer lokaliserede forskydningskræfter og mekanisk stress, hvilket fører til cellelysering og frigivelse af intracellulære komponenter.
hvad gør acetone i M3
Tilsætning af acetone sænker den samlede opløselighed af proteiner.
Hvad er en standard afvigelse
Standardafvigelse er et statistisk mål, der kvantificerer mængden af variation eller spredning i et sæt datapunkter. Det måler, hvor spredt værdierne er fra middelværdien. En højere standardafvigelse indikerer større variabilitet, mens en lavere standardafvigelse indikerer mindre variabilitet. Det beregnes ved at tage kvadratroden af variansen.
P-værdien
P-værdien er et statistisk mål, der bruges til hypotesetestning. Det kvantificerer styrken af bevis mod nulhypotesen. Nulhypotesen antager, at der ikke er nogen signifikant forskel eller sammenhæng mellem variable, mens den alternative hypotese antyder noget andet. P-værdien repræsenterer sandsynligheden for at observere dataene eller et mere ekstremt resultat, hvis nulhypotesen er sand. En p-værdi under et foruddefineret signifikansniveau (ofte 0,05) tyder på bevis mod nulhypotesen og understøtter den alternative hypotese.
Shapiro-Wilk
The Shapiro-Wilk test is a statistical test used to assess the normality of a dataset. It evaluates whether the data follows a normal distribution. The test calculates a test statistic (W) based on the correlation between the data and the expected values from a normal distribution. If the p-value associated with the Shapiro-Wilk test is above a specified significance level (e.g., 0.05), it indicates that the data can be assumed to be normally distributed.
En t-test
En t-test er en statistisk test, der bruges til at bestemme, om der er en signifikant forskel mellem gennemsnittet af to grupper eller prøver. Den vurderer, om den observerede forskel i gennemsnit er statistisk signifikant eller kan tilskrives tilfældig tilfældighed. T-testen beregner en t-værdi, som er et forhold mellem forskellen mellem middelværdierne og variabiliteten inden for grupperne. t-værdien sammenlignes derefter med en kritisk værdi fra t-fordelingen for at bestemme statistisk signifikans.
ANOVA
sammenligne gennesnittet for to eller flere grupper eller tilstande. Den vurderer, om der er signifikante forskelle mellem gruppegennemsnittene ved at analysere variansen i dataene.
hvordan sørger man for at trypsin ikke denaturer under digestion under sonikation
temperatur kontrol (isbad) i sonikatoren.
tris-hcl stabiliserer trypsin
hvad gør en vaskebuffer
hvordan virker den
den fjerner urenheder og bibeholder samtidig proteinstabilitet.
hvordan stopper man enzymatisk aktivitet
tilføje EDTA for at inhiberer enzymer.
ændre temp og pH
Hvad kan reducerer disulfid bindinger
DTT fungerer som reducerende agent, der bryder disulfidbindinger og dermed forstyrrer den tertiære struktur. Donerer en thiol (-SH) gruppe til hver disulfidbinding, hvilket får dem til at bryde og omdannes til sulfhydryl (-SH) grupper.
HVordan fungerer alkylation
Almindelig anvendte alkyleringsmidler omfatter iodacetamid (IAM) eller N-ethylmaleimid (NEM). Disse midler reagerer med de nyligt eksponerede sulfhydrylgrupper, danner stabile kovalente bindinger og forhindrer omdannelsen af disulfidbindinger.
hvad gør RESUSPEND
Genopretter frysetørrede proteolytiske enzymer.
hvad er phytochemicals
hvordan fjernes de
Phytochemicals, also known as phytonutrients, are bioactive compounds that are naturally found in plants.
Proteaser kan selektivt hydrolysere peptidbindinger i fytokemikalierne, mens de efterlader de ønskede peptider intakte.
how do you Clean peptides from hydrophobic contaminants
hydrofobe kontaminanter løbe igennem mens peptiderne holdes i filtret.
hydrofobe solventer som alkohol kan løsrive dem.
eluering
elute buffer som forstyrre bindingerne mellem peptiderne og filtret. f.eks. acetonitril, methanol) eller bufferopløsninger med høj ionstyrke eller pH-ændringer. Ved at øge elueringsbufferens ionstyrke kan de elektrostatiske interaktioner svækkes eller afbrydes, hvilket tillader peptiderne at blive frigivet fra harpiksen.
How do you Clean peptides from hydrophilic contaminants?
Patroner med passende pakningsmaterialer kan anvendes til selektivt at binde og tilbageholde hydrofile kontaminanter, mens de tillader peptider at passere igennem. Ved at justere den mobile fasesammensætning kan hydrofile kontaminanter tilbageholdes på den faste fase, og den oprensede peptidfraktion kan opsamles.
Hvordan kan vi optimere dette eksperiment med et enzym pre-treatment?
Enzymatic pretreatment of seaweed: The cell walls of seaweed are made of complex polysaccharides that are difficult for most organisms to break down. An enzymatic pretreatment step with carbohydrases (like cellulase or hemicellulase) may help break down these polysaccharides and release more accessible nutrients for the bacteria.
Hvordan kan vi optimere dette eksperiment med Strain selection?
Strain selection: Different LAB strains have different metabolic capabilities. Perhaps the specific strain you’re using is better suited to ryegrass than seaweed. Consider testing different LAB strains to find one that performs better with seaweed.
Hvordan kan vi optimere dette eksperiment med co-cultering?
Co-culturing: Consider co-culturing with other microorganisms that can complement the metabolic activity of lactic acid bacteria. For instance, certain yeasts or other bacteria could help break down components of the seaweed that the lactic acid bacteria cannot, making more nutrients available for protein production.
Hvordan kan vi optimere dette eksperiment med Nutrient supplementation?
Nutrient supplementation: Seaweed might be lacking certain nutrients that are present in ryegrass and are essential for bacterial growth and protein production. Adding these nutrients to the seaweed fermentation might improve the protein yield.
Hvordan kan vi optimere dette eksperiment med fermentation conditions for seaweed
Optimize the fermentation conditions for seaweed: Not all substrates will be equally suitable for LAB fermentation under the same conditions. Seaweed, for instance, has a different composition from ryegrass and may require different fermentation parameters (e.g., temperature, pH, duration, starter culture) to optimize bacterial growth and protein production.
