MS Flashcards
Explain EI/MS
hvilke molekyler, hvad er særligt ved dem?
Hvad sker der under prosessen?
- små molekyler som er volatile (eseasily evaported) 2. high resolution, 3. sample ind på gas fase, ion volume, generer en beam af elektroner, tranverse the flow, induce collision, energi, elektron rammer ind i en anden elektron -> derfor protoner.
hvor mange aminosyrer skal der være og hvorfor
6-30 aminosyrer, fordi så får vi mange flere peptider og så er det mindre sandsynlighed for at to peptider er fra den samme. men størrelsen på peptidet er stadig småt nok til ioniseringen
Forklar hvad en C-trap, hvor den er lokaliseret og hvad dens funktion er
The C-trap is a three-dimensional radio frequency (RF) ion trap that is typically located between the quadrupole mass filter and the Orbitrap or TOF analyzer. Its main function is to accumulate and store ions for subsequent analysis.
Hvad står TOF for
Hvad er det?
Hvad måler den?
Rejser tunge ioner hurtigt eller langsomt og hvorfor
små molekyler har …. kinetisk energy
store molekyler har …. kinetisk energy
Time of flight
mass analyzer
måler tiden det tager ioner at rejse en kendt distance fra ion source til detectoren baseret på deres masse til charge ratio. tunge ioner rejser langsommer fordi de har en højere m/z værdi.
små: høj
store: lav
Analytes must be on “x” phase when reaching the MS (UHV) interieur.
hvorfor
gas
for at kunne kontrollere det i high vacuum
hvordan laver man det på gas fase, hvis det ikke er det i forvejen
- varme (volatiles), 2. indeni ion source (liqiud/solid)
direct injektion: usikkerheder
kan give mange støjende signaler, medmindre man har en oprenser
Chromatografi - what is the point
- adskille anaylytter i komplekse prøver som en funktion af tid
- kan tilføje en ekstra dimension (time-resolution)
- reducerer komplektisiteten
- improve sensitivity. kommer ikke mange ting ind på SAMME tid.
Forklar stationær fase, loaded sample og mobile fase.
man har en stationær fase i bunden af coloum, man har sin loaded sample i toppen, introducerer en mobil fase, så lader man det løbe igennem systemet. baseret på styrken af interaktioner som analytten har med materialet i colum, så får man seperation, det første man eluder er de svage interaktioner, og derefter de stærkere.
Forklar hvad Retention time betyder og hvad man får ud af det.
The time at which a compound eludes from the column.
Obtain a Mass
Spectrum each time a component comes out of your chromatographic column.
Get isolated Mass Spectra for each of the compounds
BPC
Base peak cromatrogram
y = intensiteten af de mest intense ioner ved ethvert tidspunkt.
do we have some dominating
ions that are eluding at specific times
TIC
summen af alle ioner ved ethvert tidspunkt.
EIC
extracted ion cromatrogram : only the signal from a specific Ion at a
given time point which tells us much
more on the single compound level
GC
liqiud sample, inject it, vaporise components, spereate in colomb (ovn)
EI will generate
ESI
molecular ions
protonated molecular ion species.
ESI apply a strong electric field to a x, that passes through a x
apply a strong electric field to a liquid that passes through a capillary
ESI: hvad skal der ske med prøven inden den når ESI source
ions must be formed in solution prior to going into the Ms and prior to
reaching the ESI Source because it is strictly not a ionization method it’s basically just an
interface that allows you to transfer and and produce isolated ions from ions in a liquid or a gas
forklar hvad er der sker i ESI
hvad gør det elektriske feldt?
prøven kommer ud i enden af the cappilary, former en taylor cone, så kommer der dråber ud, der kommer mindre dråber pga droblet fission, som efterhånden til bliver til gas også ladet ioner.
Elektrisk feldt flytter ionerne mod MS
er der høj eller lav pH i the capillary, hvorfor vil man holde pH lav i positive mode?
hvilke syre holder ph lav
LAV pH, man vil gerne holde den lav fordi, så man protonerer sine molekyler, så man har dem i en ioniseret form inden de når ESI grænsefladen
ammonium acetate og acetate acid, formic acid
Fordele ved ESI
blød teknik, derfor ødelægger vi ikke skrøbelige biologiske molekyler. bred masse range, kan bruges sammen med LC, can make multiple charged ions.
Ulemper ved ESI
sensitiv overfor salte, fordi de laver adduct, som kan forstyrre Mass spektrum og fortolkning.
ESI er ikke godt for non-plar compounds, fordi man arbejder i vandige opløsninger vil man gerne have noget opløseligt.
MALDI er tolerant overfor buffere og salte, men maldi er ikke godt med LC.
Hvordan virker Quadrople.
Hvorfor er det smart med et elektrisk feldt.
Hvordan kommer kun resonante ioner gennem til detektoren?
Består af fire (poler) monteret i en firkant
Ved at anvende veksel- og jævnstrømme på polerne, hvor de to er modsat ladede, genereres et svingende elektrisk felt mellem dem. ionen svinger afhængigt af dette felt. Det er smart fordi så kan man kontrollerer ioner med det elektriske feldt, styrken og størrelsen kan påvirke ionernes stabilitet. Resonante ioner er de stabilie, så de vil gå gennem detektoren og de ikke resonante-ioner vil kolliderer med the rods og ikke blive opfanget.
Forklar hvordan orbitrap virker
hvad er centroden
hvad menes der med aksialt og vinkelret
hvordan måles frekvensen, og hvad laves den til om til ?
Indæstter ionerne, så har vi et elektrisk potentiale applied til centroden, og derved svinger ioner rundt og rundt om centroden.
Den svingning går både aksialt og vinkelret, så en svinger rundt om og en svinger frem og tilbage langs z-aksen.
Vi kan måle frekvensen og derefter bruge fourier transformationen til at lave det om til et m/z spektrum, hvor hver frekvens svarer til en partikulær m/z værdi.
Hvad er CID
Hvad er sket før CID
Hvad sker der inde i CID,.
Hæves eller sænkes trykket, hvad sker der med vacum.
Hvilken ion-form kommer de på?
vi har allerede lavet M+1 ion i MS1 under high vacum. i CID indpumpes en inert gas som ikke kan intergaerer med andre. trykket hæves (sænker vakum) så disse inerte gasser koliderer med M+1. resulterer i M_2 + n (neutral) og overførs til MS2
styrker ved Tandem
high speed of analysis
high accuraracy
high sensitivity og høj kapacitet, fordi vi kan analyserer mange fragmenter/sekund
Triple quadrople, hvad gør quad 1, 2, 3
Quad 1: select ions
quad 2 collision cell (fragmenterer controlleret) (lineær iontrap) Quad + RF
Quad: scan , sorting of ions baseret på m/z ratio
Buttom up
only one protein, take the protein, digest it with trypsin, seperate the peptide vha LC, generate MS1 and then MS2
Shot gun bottom up
a mixture of protein, digest it with trypsin, seperate the peptide vha LC, generate MS1 and then MS2
Hvordan laver man precurser ions
Vi finder ud af hvilke peptider vi har og hvilke charge state disse peptider har. så kan man fortælle mass analyser hvilken type der må passerer.
FAB: Forklar kort hvordan denne ioniseringsform fungerer og hvilke applikationer den med fordel kan benyttes til.
Ion source?
Hvilke ioner laves?
Pro og cons?
Analytter sættes i flydende matrix.
Matrix er lavet af glycerol.
Matrixen bombareres med intert atomer som Ar, Xe.
Laver protonerede ioner.
Ion source: atom beam
M+H, M+Na, M-H
Pro:
Hurtigt og simpelt, godt med thermostabile compounds,
Cons:
Analytter skal kunne opløses i matrix
Dårligt for z>2
Lav sensitivitet
Ingen bibliotek.
hvordan hjælper softwaren med at finde proteinet?
Software: Generer potentielle peptides, generate teoretisk MS2 spektre, matcher den ekperimentielle med den teoretiske, baseret på den scorer den vores analyse og målinger, og beregner sandsynligheden for at det er korrekt identifikation af et protein. Så vi identificere individuelle peptider og derefter bygger dem ind i proteinet, fordi vi har mange peptider fra det samme protein og har derfor bevis for at det er det protein som er tilstede.
Reducing/alkylation
disulfidbindinger gør at aminosyrerne er krydsbundet, så derfor reduceres de, men for at undgå der komme nye disulfidbindinger igen andre steder i det samme protein eller med andre proteiner, derfor alkylerer/blokerer man med et kemikalie som binder til den frie thiol som blev lavet under reduktionen
FAB: Forklar kort hvordan denne ioniseringsform fungerer og hvilke applikationer den med fordel kan benyttes til.
Ion source?
Hvilke ioner laves?
Pro og cons?
Analytter sættes i flydende matrix.
Matrix er lavet af glycerol.
Matrixen bombareres med intert atomer som Ar, Xe.
Laver protonerede ioner.
Ion source: atom beam
M+H, M+Na, M-H
Pro:
Hurtigt og simpelt, godt med thermostabile compounds,
Cons:
Analytter skal kunne opløses i matrix
Dårligt for z>2
Lav sensitivitet
Ingen bibliotek.
MALDI
hvad er matrixen lavet af
hvad gør laseren
hvad for nogle charge species laver den
flydende prøve og blander det med en matrix og så lader man det tørre og krystalliserer. Prøven og matrix skal vøre opløslige, maxtrix absorberer energy ved en specifik bølgelængde (337 nm som er laseren vi skyder med), skal være low mass og inert.
Godt for low compleksity samples.
laser ødelægger overfladen og generer ioner, UV laser exiterer matrixmolekylerne, overfører ladningerne til analytterne. så matrix absorberer ved 337 og overfører energien til prøven, som får ladninger.
matrix: solid crystaline
generer single charge species (M+H og M+Na)
EI laver hvilke ioner:
ESI laver :
EI: M+
ESI: M+1
EI, hvordan fungerer dette, og hvad gør en repeller?
prøve vi introducerer på gasfase. kommer ind i “ion volume”, hvor vi har et potential applied, som generer beam af elektroner, som inducerer kollisioner med analytterne i ion-volume, der kommer meget energi ud af denne kollision, hvor en elektron slår en elektron fra en analytterne, dermed bliveranalytten positivt ladet.
bombardere molekylerne, der generes ioner, laver Me- -> M+ + 2e.
Laver et nyt “potential” som accelererer ionerne mod mass analyser . Repeller laver et elektrisk feldt som presser analyten mod retningen af mass analyzer.
Pros of EI
Cons of EI
Simple, sensitivt, library search, fragmentering kan faciliterer identifikation.
Cons: skal være volatile (kunne komme på gas form), thermo stabilt, over fragmentering kan ødelægge fortolkningen af data, kan kun bruges i en lille masse range under 1000 Da
Nano ESI
samme som ESI, men man arbejder med nanoflow, meget lille prøve (piko range).
Maldi: pros and cons
pros: fast, bred mass range, robust overfor salte.
cons: low mass region , cluster matrix ions, ikke godt med LC.
FAB
hvordan gør den:
ionisering teknik blød eller hård?
mass range:
bombarderer prøven med en beam som består af en inert gas, som laver ioner. sample er opløst i glycerol og bombarderes med elektroner og producere protoneret molekyle species (M+H og M+Na) og M-H).
soft ionisering teknik. godt for analyse af volatiler.
Mass range: 300-600 Da
FAB: pro and cons
pro: hurtigt, good for thermally labile compounds, simple, cons: high chemical background, analytes must be soluble in matrix, no library, low sensitivity, bas for z>2.
Hvad er pricippet bag MS
The basic principle of mass spectrometry (MS) is to generate gas-phase ions from either in-organic or organic compounds by any suitable methods, to separate these ion by their mass to charge ratio (m/z) and to detect them by their repective m/z and abundance.
Genererer gas-fase ioner
seperere ionerne ift m/z
Find ud af hvilke ioner de er ud fra m/z og abundance
Hvad er formlen for charge state
m/z = (M+nX)/n
Accuracy
Precision
Accuracy describes the deviation of the experimental value from the true value.
Precision is an expression of random error, as introduced by noise, variation in injection volumes or times.
mass analyzer laver
seperation af ioner baseret på m/z value
hvad er problemet med TOF i lineær mode
forskellige tidpunkter accerlationen starter for de forskellige analytes.
et molekyler kommer ioniseret form før den anden pga forsinkelse i ionisering.
kinetiske start energi er forskellig.
hvordan kan man afhjælpe problemet med TOF
reflector mode: en potential som bliver tilsat i modsat retning, så vi har analytter i en retning som er positivt ladet, de ryger ind i et positivt potentiale fra RF, som gør de vil “vendt om”, så ryger de ned til en sekundær RF detector. RF unit hjælper med at fokuserer dem, så man får en bedre opløsning.
hvad er post source decay
når man i TOF har acceleret dem ind i field free drift path, vil alle molekyler ikke være stabilie og vil starte med at fragmenterer, disse fragmenter er upåvirket af et feldt, så de har den samme kinetiske energi, og rammer detektoren på samme tid, så man kan ikke vide om det er et intakt molelyle eller et fragment af molekylet og vil detekte alle disse som intakte molekyler. så sensiteten har ned ved at forbedre opløsningen.
hvad sker der når man sætter DC til nul?
transformere quadropole til et “wide band pass for ions”
forklar CEM
ion kommer ind i detektoren, elektron multiplier, hvor man, man generer sekundær elektroner, som reflekteres ind i en ny del, hvilket gør der kommer flere og flere, hvilket betyder at man kan generere mange elektroner baseret på en enkelt ion, hvilket gør MS meget sensitivt.
HRMS cons
Resolution = tæthed ved datapoints
sharper peaks
isotopic resolution at higher charge states
resolve closely situated species
forbedre mass accuracy
increase depth of data (info og kvalitet)
deconvolution, hvad er det og hvad bruges det til?
different charge states of two species, kan bruge dette til deconvulution, vi tager alt info fra alle forskellige charge states og vi kombinerer dem til en repræsentation af enten den single charge molecule eller den uladet molekyle direkte på en mass skala istedet for en m/z scale. vi bruger de forskellige charge states for at få et bedre estimat af massen af molekylet fordi når vi laver et gennemsnit får vi mere input data, flere målinger = større sample size , mere akkurat vil estimatet være
degree of fragmentation can be controlled by the …
vibrational energy will support
degree of fragmentation can be controlled by the gas pressure
fragmentation
HCD (High energy c -trap dissociation)
istedet for at bruge iontrap som collision cell bruger man c-trap som collision cell, kun relevant i orbitrap instrumenter.
forhøjer voltage i c-trap, nitrogen trykket som er tilstede i vil være nok til at virke som collision gas, så man lave fragmenter indeni c-trap ved at forhøje voltage.
Top down proteomics
tager et protein og undersøger det med MS1 og derefter MS2. vi har et intakt protein, vi analyserer hvad der er og så fragmenterer vi det kontrolleret og undersøger fragmenterne. godt hvis man har isolerede proteiner.
DDA og DIA forskel
DDA: fragmentering af udvalgte precurser ions
DIA: fragmentering af alle precurser ion i hvert vindue + low abundant fragments
EI arbejde med HRMS eller LRMS
LRMS
Even elektron rule
hvad kan ikke lade sig gøre
Odd- > bliver til -> even + tab af Radikal
Odd- > bliver til -> odd + tab af n
Even -> even + n
NO: even til odd + R
Stephenson rule
når en fragmentering finder sted, forbliver den positive ladning fortrinsvis på fragmentet med den laveste ionisering
energi
You synthesize a peptide with the sequence PARCPER. Calculate the mass of the peptide and supply the answer with three decimal accuracy.
fortæl hvordan regnes dette ud?
Add relevant residue masses from table A15.
Additionally add 1xO (15.994915) and 2xH (1.007825) to represent N- and O-termini.
billede fra live
pro , (produkt) ,
perry, (precurser)
never, (neutral loss)
misses (miltiple ions)
MS1: Fix. scan, scan fix.
MS2: S,F,S,F
What is the purpose of the reflector in MALDI-TOF?
A reflector is a static or time-dependent electrical field used to improve mass resolution ins Time- of-Flight by minimizing the kinetic spread of energies.
improve resolution and measuaring of components
Nominal mass
Integer mass of the most abundant isotope of each element
C2H5OH; 12C (12 u), 1H (1 u), 16O (16 u)
Rel. atomic mass
The weighted average of the masses of isotopes of an element
Example: Bromine; 50.69% 79Br (78.91834 Da); 49.31% 81Br (80.91629 Da)
Rel. atomic mass = (0.5069)(78.91834) + (0.4934)(80.91629) = 79.904 Da
Monoisotopic mass
Sum of masses of atoms in a molecule using most abundant isotope of each element.
12C (12 u), 1H (1.00782 u), 16O (15.99491 u)
Average mass
Sum of the averaged masses (i.e., rel. atomic mass) of the constituent elements of a molecule.
Example: C2H5OH, C (12.011 u), H (1.008. u), O (15.9994 u)
